低溫氬氧等離子體處理的無機牛骨對MC3T3-E1細胞黏附、增殖及分化的影響

馬凱 李昊 趙紅梅 王永亮 劉杰 柏娜

青島大學附屬醫(yī)院口腔修復科 青島大學口腔醫(yī)學院 青島 266003

外傷、腫瘤、先天畸形造成的骨缺損以及種植外科常常需要用到骨移植技術。目前該技術預期效果最佳的是自體骨移植，但自體骨移植同時存在增加手術創(chuàng)傷及手術并發(fā)癥等缺陷；此外，同種異體骨移植也是常用的骨移植技術，但該技術也存在感染和免疫反應等問題。綜合這些因素，人工骨替代材料在骨移植技術中具有廣闊的發(fā)展前景[1-2]。

無機牛骨是臨床常用的骨替代材料，主要成分是羥磷灰石，為多孔顆粒狀，能促進血管長入并能維持血凝塊的穩(wěn)定，為骨組織新生提供早期的營養(yǎng)供應[3]；但該材料只具有骨引導特性，不具有骨誘導特性[4]，且長時間放置于空氣中，材料表面易吸附空氣中的雜質從而影響其生物活性。作為合格的骨移植材料，良好的生物相容性是首要條件。雖然目前人工骨替代物在臨床中應用廣泛，但在人體研究中，人工骨替代物表現(xiàn)出重塑不完整的特征，?？蓹z測到殘留。臨床上在骨缺損區(qū)植入人工骨替代物后，大部分患者需要6個月甚至更長時間的愈合期，這就延長了后期修復的時間。有學者[5]認為，骨移植術的成功也受到其他因素的限制，包括外科手術感染、宿主骨重塑能力、材料本身吸收不足及材料毒性等。因此，對無機牛骨材料進行適當?shù)谋砻嫣幚?，是提高其成骨效率、改善骨缺損修復的有效路徑之一。

等離子體（plasma）是用來描述電離氣體的術語，分為熱等離子體和低溫等離子體。熱等離子體作為一種表面涂層技術，可以將金屬和陶瓷噴涂到其他材料上。金屬顆粒如鈦或銀以及羥磷灰石都是通過熱等離子體噴涂技術對牙科或骨科植入物進行處理來強化其生物相容性。與此相反，低溫等離子體的溫度較低，可以通過滅菌、凝血、傷口愈合和組織再生直接治療活體組織，或通過將等離子體處理的材料植入活體組織進行間接治療。在骨和軟骨再生生物材料的處理中，低溫等離子體具有潛在的優(yōu)勢，但目前關注無機牛骨替代物經(jīng)低溫等離子體處理后生物學效應的研究還較為少見[6]。

低溫等離子體進行材料表面改性時，可以在短時間內(nèi)于材料表面連接大量的、不同種類的化學功能團，使材料表面的反應活性顯著改善；另外該工藝還具有效率高，能耗低，安全且無二次污染，簡單易行，常壓下操作時無需價格昂貴的真空設備和繁瑣耗時的操作程序等優(yōu)勢。低溫等離子體的這些優(yōu)點使其具有在常溫常壓環(huán)境下對骨替代材料進行適當?shù)谋砻嫣幚淼目赡苄?，有望在植入前對骨替代材料的特性進行改善。本實驗使用低溫氬氧等離子體對無機牛骨進行表面活化，觀察活化后的無機牛骨對成骨細胞黏附、增殖和分化的影響，探討低溫氬氧等離子體能否改善無機牛骨生物學特性，為臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 無機牛骨（塊型，5 mm×10 mm×20 mm，煙臺正海生物科技股份有限公司）；小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1（中國科學院上海細胞庫），α-MEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素、CCK（cell counting kit）-8試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、TritonX-100（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.1.2 主要儀器 AS400型低溫氬氧等離子體發(fā)生裝置（Plasmatreat GmbH公司，德國），BIOBASE-EL 10A型酶標儀（濟南博科公司），CKX53型倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），Phenom Pro型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）（Phenom公司，德國），Nexsa? X型X射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀和Forma?8000型CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和低溫氬氧等離子體活化 將無機牛骨先用紫外線燈照射消毒2 h，消毒完畢后用無菌環(huán)切刀和醫(yī)用無菌刀片將骨塊制備成直徑5 mm、高度2 mm的圓柱狀骨塊，制備完畢后再用紫外線燈照射消毒2 h，備用。使用低溫氬氧等離子體對無機牛骨進行等離子體活化，設為實驗組，不作處理的無機牛骨為對照組，每組3個樣本。低溫氬氧等離子體系統(tǒng)原理如圖1所示，它是一個尺寸為33 cm×12.5 cm的輝光放電等離子體工作區(qū)，由射頻功率為20 kHz的電源和匹配網(wǎng)絡供電。調(diào)整設備參數(shù)為電壓320 V，電流0.3 A，氣體以500 L·h-1的速度流至噴射口，借助于與控制系統(tǒng)一起工作的集成式質量流量計，可以確保精確的流速?；骞潭ㄔ阡X板上，實驗中將骨塊固定在基板上距離低溫等離子體噴射口2.5 cm的位置，以氬氣＋體積分數(shù)5%氧氣作為輸出氣體產(chǎn)生低溫氬氧等離子體，處理骨塊60 s[7]。

圖 1 低溫氬氧等離子體系統(tǒng)原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of low temperature argon-oxygen plasma system

筆者通過前期預實驗結果發(fā)現(xiàn)，低溫氬氧等離子體的處理時間與骨塊表面溫度和骨塊表面形貌密切相關（圖2）。

圖 2 低溫氬氧等離子體系統(tǒng)處理時間與材料表面溫度的關系Fig 2 The relationship between treatment time of low temperature argon-oxygen plasma system and surface temperature of materials

處理時間為60 s時，骨塊表面溫度約為80 ℃，表面形貌沒有明顯變化；處理時間為60～100 s，表面溫度會緩慢上升15 ℃左右；隨著處理時間延長，表面溫度穩(wěn)定在這一水平不再升高，但是會出現(xiàn)骨塊表面干裂及內(nèi)部連接結構斷裂的情況（圖3）。為保證低溫氬氧等離子體發(fā)揮其活化能力又不引起骨塊表面形貌變化，本實驗選用的處理時間為60 s。

圖 3 溫度過高導致骨塊內(nèi)部連接結構斷裂 SEM × 2 000Fig 3 The excessive temperature caused the fracture of the internal connecting structure of the inorganic bone SEM × 2 000

1.2.2 SEM觀測表面形貌 使用SEM觀察實驗組和對照組的表面形貌。SEM觀察前，骨塊表面涂覆鈀金以獲得更好的成像質量，加速電壓為10 kV，放大倍數(shù)為2 000倍和10 000倍。

1.2.3 XPS分析表面元素組成 采用XPS儀對實驗組與對照組進行表面元素和化學分析，收集高分辨率C1s、O1s、Ca2p和P2p的光譜。激發(fā)源采用Al kα射線（hv=1 253.6 eV），工作電壓12.5 kV，燈絲電流16 mA，并進行10次循環(huán)的信號累加。測試通能為40 eV，步長為0.1 eV，并以C1s=284.60 eV結合能為能量標準進行荷電校正。實驗組骨塊在空氣中暴露2 d后，再用同樣的方法分析該組表面元素組成。

1.2.4 細胞早期黏附 使用24孔板，將MC3T3-E1細胞以每孔2×106個細胞的密度接種在實驗組和對照組骨塊上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、90%、100%乙醇各脫水15 min），噴金處理后于SEM下觀察細胞形態(tài)。

1.2.5 細胞增殖實驗 使用96孔板，調(diào)整MC3T3-E1細胞密度至每毫升3×105個，取100 μL細胞懸液接種于實驗組和對照組骨塊表面，2 h后沿孔壁邊緣緩慢加入100 μL培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)2 h、4 h、1 d時在顯微鏡下觀察細胞在骨塊表面的生長情況。在1、3、5 d更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液200 μL，隨后每孔加入10 μL CCK-8試劑，將96 孔板置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 細胞分化實驗 使用96孔板，調(diào)整MC3T3-E1細胞密度為每毫升5×105個，取100 μL細胞懸液接種于實驗組和對照組骨塊表面，用含抗壞血酸成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第7、14天后使用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔中加入120 μL細胞裂解液，經(jīng)反復凍融處理使細胞膜破裂，收集細胞，按ALP試劑盒說明書操作，使用酶標儀測定405 nm處OD值，根據(jù)公式換算出ALP的活性。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α= 0.05。

2 結果

2.1 表面形貌

SEM觀察顯示，對照組與實驗組的表面形貌沒有明顯差異，提示等離子體表面處理沒有對骨塊表面造成明顯的損傷，仍表現(xiàn)為粗糙的表面（圖4）。

圖 4 實驗組和對照組的表面形貌 SEMFig 4 The surface morphology of the experimental group and control group SEM

2.2 XPS檢測

對照組與實驗組的表面元素百分比如表1所示，可以看到兩組骨塊表面的元素組成相同，但百分比存在差異。實驗組骨塊表面碳（C）元素百分比減少，氧（O）、磷（P）、鈣（Ca）元素百分比有所增加。

表 1 兩組骨塊表面元素百分比的XPS分析Tab 1 XPS analysis of the percentage of bone surface elements in two groups %

各個元素XPS峰值結果見圖5。實驗組經(jīng)過低溫氬氧等離子體處理后，在 531.1 eV 處O1s光電子強度提高，說明氬氣（Ar）和氧氣（O2）的混合氣體在骨塊表面產(chǎn)生了活性氧基團（圖5B）；此外，實驗組Ca2p（347.1 eV）、P2p（130.6 eV）的光電子強度也有明顯增加（圖5C、D）。實驗組C1s在284.60 eV的光電子強度明顯減少（圖5A），說明低溫氬氧等離子體可以有效去除骨塊表面的有機雜質。

實驗組處理后放置于空氣中暴露2 d，再次進行XPS檢測，結果見圖6：實驗組表面元素百分比呈現(xiàn)動態(tài)變化，骨塊表面的碳（C）元素百分比明顯增加，而氧（O）、磷（P）、鈣（Ca）元素百分比均減少。

2.3 細胞早期黏附

兩組骨塊表面MC3T3-E1細胞的早期黏附情況見圖7和圖8。對照組：細胞大多呈球形黏附于材料表面（圖7A），進一步放大可見細胞成球形且有偽足形成，但無明顯鋪展（圖7B）。實驗組：細胞多數(shù)為鋪展狀態(tài)，呈多邊形（圖7C紅線標記處），進一步放大可見細胞鋪展較為充分，周圍延伸出厚而長的突觸（圖7D紅線標記處）。由圖8可見，實驗組表面成骨細胞的黏附面積百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.4 細胞增殖

CCK-8法測定的MC3T3-E1細胞增殖結果見圖9，隨著時間延長，細胞在兩組骨塊上的增殖數(shù)量逐漸增加，對照組1 d與3 d、1 d與5 d的細胞增殖數(shù)量的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），實驗組1 d與5 d、對照組1 d與實驗組5 d的細胞增殖數(shù)量的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；實驗組在培養(yǎng)1、3、5 d時的細胞增殖數(shù)量均高于相應培養(yǎng)時間的對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖 5 XPS檢測兩組骨塊表面元素的變化Fig 5 XPS detected changes in bone surface elements in the two groups

圖 6 實驗組即刻及暴露2 d后表面各元素百分比Fig 6 The percentage of surface elements in the experimental group after immediate and 2 days of exposure

2.5 細胞分化

MC3T3-E1細胞的ALP檢測及分析結果見圖10。由圖10可見，隨著時間延長，MC3T3-E1細胞在兩組骨塊上的ALP活性逐漸增加。對照組培養(yǎng)7 d與培養(yǎng)14 d、實驗組培養(yǎng)7 d與培養(yǎng)14 d的ALP活性差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗組在培養(yǎng)7 d時，MC3T3-E1細胞的ALP活性與對照組無明顯差異（P>0.05），而在培養(yǎng)14 d時，MC3T3-E1細胞ALP活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖 7 對照組和實驗組表面MC3T3-E1細胞形態(tài) SEMFig 7 MC3T3-E1 cell morphology on the surface of the control group and the experimental group SEM

圖 8 實驗組和對照組表面成骨細胞的黏附面積百分比Fig 8 Percentage of adherent surface area of osteoblasts in the experimental group and control group

圖 9 MC3T3-E1細胞增殖結果Fig 9 Proliferation of MC3T3-E1 cells

圖 10 MC3T3-E1細胞ALP活性檢測結果Fig 10 ALP activity of MC3T3-E1 cells

3 討論

作為近年來使用頻率較高的一種骨替代物，無機牛骨具有良好的生物相容性，形態(tài)和化學結構與礦化人骨相似，因此在臨床上應用廣泛，并取得良好的成骨效果。但臨床實踐也發(fā)現(xiàn)，該材料存在不易被機體完全吸收的缺點，因此如何改善其成骨效果成為近年的研究熱點。Schmitt等[8]用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子修飾無機牛骨粉使其具有骨誘導功能，增強成骨效果，但蛋白質合成工序復雜、價格昂貴，植入體內(nèi)可能會引起免疫反應或感染，限制其臨床應用。高媛媛等[9]使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸構成的三肽序列（arginine glycine aspartic acid，RGD）修飾無機小牛骨粉來增強成骨效果，結果發(fā)現(xiàn)，無機牛骨與RGD物理結合后可促進細胞黏附及分化，但對細胞增殖沒有促進作用，且RGD溶液的制備需嚴格控制濃度，臨床推廣存在一定的困難。由此可見，如能找到一種簡單、高效的表面處理方式來增強無機牛骨的成骨效果無疑非常有助于其臨床應用。

等離子體是一種由自由電子和帶電離子為主要成分的物質形態(tài)，廣泛存在于宇宙中，常被視為物質的第四態(tài)，被稱為等離子態(tài)[10]。等離子體已廣泛應用于工業(yè)表面處理，包括清洗、活化和表面鍍膜[11]，而低溫等離子體具有低溫、高效的優(yōu)勢，近年來在生物醫(yī)學領域受到廣泛關注[11]。Duske等[12]采用低溫氬氣等離子體處理不同表面的鈦片，之后復合成骨細胞進行培養(yǎng)，SEM下觀察到處理組細胞的伸展程度明顯提高。稀有氣體的混合物，如氬（Ar）和氧（O2）以一定比例混合后，作為亞穩(wěn)稀有氣體種類可攜帶大量的能量，在低溫等離子體的環(huán)境中可以通過能量轉移反應導致活性氧物質的形成，使得材料表面能大幅增加[13]。由此推測，若使用氬氣和氧氣的混合氣體產(chǎn)生的低溫等離子體處理無機牛骨表面，可能會產(chǎn)生更理想的骨反應。

本實驗使用氬氣+5%氧氣產(chǎn)生的低溫氬氧等離子體處理無機牛骨塊，通過SEM觀測其表面形貌，可知對照組與實驗組的表面形貌沒有明顯差異，說明低溫氬氧等離子體不會破壞無機牛骨表面的結構，這與之前的研究[14-15]結果相同。低溫氬氧等離子體處理骨塊前后的XPS結果顯示，實驗組的氧（O）、鈣（Ca）、磷（P）元素峰值均較對照組增高，而碳（C）元素峰值較對照組減少，這可能是因為等離子體處理后會引起材料表面的化學變化，具體表現(xiàn)為碳氫化合物含量的減少和羥基（-OH）、羧基（-COOH）等官能團的增加[16]。自然界中存在的碳元素會不可避免地附著在材料表面，碳在表面的吸附會引起生物活性降低[17]，從而影響無機牛骨和成骨細胞的結合；而等離子體的表面清潔[18]作用會有效去除無機牛骨表面的碳雜質，有利于成骨細胞的附著。Fran?a等[19]在2014年指出，從生物陶瓷中去除這些雜質是很重要的，因為它們會影響材料植入骨再生過程中的力學性能。因此筆者認為，低溫等離子體可以去除材料表面的雜質，有利于細胞附著，后續(xù)實驗結果進一步證實了這一推測。氧元素含量增加有助于增加材料表面能，促進細胞早期黏附，而鈣、磷作為骨組織代謝中的重要元素，其含量的增加同樣有利于細胞的早期附著及形成良好的細胞形態(tài)[20]。然而，低溫等離子體處理材料后，表面化學構成隨著時間延長也會發(fā)生改變。有學者[21]進行了低溫等離子體處理鈦片的相關實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過等離子體處理后的鈦片表面的接觸角均值隨著在空氣中放置時間的延長而迅速增大，本實驗也發(fā)現(xiàn)實驗組暴露于空氣中2 d后，其表面元素發(fā)生了明顯變化。這可能是由于材料表面官能團半衰期較短，表面氧化膜與空氣中的碳氫化合物發(fā)生反應，材料親水性下降[22]。

成骨細胞早期黏附的觀測結果顯示，對照組表面的成骨細胞呈球形，未見明顯的伸展，而實驗組表面的成骨細胞呈多邊形扁平狀，表現(xiàn)出良好的黏附和伸展性能，同時可以觀察到成骨細胞在材料表面延伸出厚而長的突觸。這一結果表明，經(jīng)過等離子體活化后的無機牛骨有利于成骨細胞的早期黏附。這可能與等離子體處理后材料表面氧元素增加和碳雜質降低有關。有研究[23-24]證明，氧元素含量升高，碳元素含量降低有利于增加材料表面的親水性和表面能，而材料的表面能在促進早期細胞黏附中起著重要作用。

本實驗中細胞增殖檢測結果顯示，經(jīng)過低溫氬氧等離子體處理過的骨塊表面細胞增殖明顯高于對照組，說明經(jīng)過活化的骨塊表面可有效提高成骨細胞的增殖能力，這可能與骨塊表面活性增加有關。研究[25]表明，生物材料的表面特征可以直接影響細胞反應，從而影響新組織的生長速度和質量。成骨細胞在分化早期即表達ALP，ALP被認為是細胞外基質成熟的早期標志，因此ALP檢測是一種簡單、經(jīng)濟的成骨細胞特異性檢測方法。本研究ALP檢測結果顯示，實驗組在7、14 d的成骨活性均高于對照組，說明等離子體的表面活化對骨形成具有一定的促進作用。

無機牛骨作為一種人工骨替代物，目前已經(jīng)廣泛應用于種植及引導組織再生領域。本實驗使用低溫氬氧等離子體對其進行活化，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的無機牛骨對細胞黏附、增殖及分化均有一定的促進作用，同時不改變材料本身的表面形貌及化學組成。綜合本研究結果可以認為，低溫氬氧等離子體活化的無機牛骨在增強成骨能力方面有良好的前景，但還需進一步研究。