心臟死亡大鼠供體角膜移植排斥模型建立

曹 倩，李 蘭，鄒 瑩，李云川，李 勇，龍俊君，劉浩文，何柳余，田二苗

（昆明市第一人民醫(yī)院眼科，云南昆明 650032）

我國(guó)有大量的角膜盲患者，角膜移植術(shù)是其唯一的復(fù)明方式。目前，我國(guó)心臟死亡供體捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）角膜是角膜移植植片的主要來(lái)源[1]。而角膜移植術(shù)后免疫排斥仍是手術(shù)失敗的主要原因[2-3]，因此角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的防治成為角膜移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。既往制備心臟死亡供體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法包括注射氯化鉀、麻醉+呼吸機(jī)撤除（窒息）、放血以及電擊誘導(dǎo)心臟驟停等。這些方法或可能存在藥物因素影響，或提前產(chǎn)生器官的缺血損傷，或與臨床DCD供者的死亡模式差異較大，難以模擬臨床實(shí)際情況[4]。大鼠由于角膜MHC抗原的表達(dá)與人類角膜相似，實(shí)驗(yàn)抗原購(gòu)買方便，相比其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物價(jià)格低，且比小鼠角膜移植難度低，眼科研究中常用大鼠眼球做動(dòng)物模型[5]。目前大鼠角膜移植動(dòng)物模型多是參考Williams的方法[6]。本實(shí)驗(yàn)參考了既往實(shí)驗(yàn)的基本方法，對(duì)一些造模細(xì)節(jié)有所改進(jìn)及創(chuàng)新，總結(jié)了影響心臟死亡大鼠供體角膜移植排斥模型建立的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)，供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性SD大鼠，體重220～250 g，無(wú)眼部疾患[由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]均取右眼作為手術(shù)眼，保留左側(cè)正常眼不影響大鼠術(shù)后進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[7]。

1.1.2 主要試驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備 主要試劑：10%水合氯醛、0.9%生理鹽水、聚維酮碘、Optisol角膜保存液、慶大霉素注射液、妥布霉素眼膏。

主要設(shè)備：體視顯微鏡、角膜移植手術(shù)器械、維納斯剪。

1.2 方法

50只成年雌性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為供體組（10只，20眼）、實(shí)驗(yàn)組（同種異體角膜移植組20只，20眼）、對(duì)照組（自體角膜移植組20只，20眼）。

1.2.1 供體準(zhǔn)備 供體植片準(zhǔn)備：成年雌性SD大鼠，體重220～250 g，使用5 mL注射器抽取5 mL空氣，戴棉線手套固定好大鼠頭部及尾部，防止抓傷。于大鼠左側(cè)肋骨角偏左上方心臟方向處進(jìn)針，回抽見(jiàn)血液確定穿刺部位位于心腔，注射5 mL空氣處死SD大鼠，從而建立心臟死亡模型。將大鼠左側(cè)臥位，頭部固定于自制的大鼠頭部固定枕上，見(jiàn)圖1A、圖1B，使眼部處于與手術(shù)臺(tái)平行位置。術(shù)前使用5%～10%聚維酮碘消毒結(jié)膜囊3 min以上[8]，0.9%生理鹽水再次沖洗結(jié)膜囊。顯微有齒鑷固定9點(diǎn)方向角膜鞏膜緣，使眼球呈輕度脫臼狀態(tài)。1 mL注射器于3點(diǎn)方向穿刺入前房，維納斯剪順著穿刺點(diǎn)進(jìn)入前房沿角膜緣360°剪下全層角膜供體。將供體角膜上皮面朝上放于4.25 mm環(huán)鉆臺(tái)中央鋪好后，將環(huán)鉆壓于環(huán)鉆臺(tái)上制作植片，植片制作完畢后置于Optisol保護(hù)液中備用。

1.2.2 同種異體角膜移植（實(shí)驗(yàn)組）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后同供體準(zhǔn)備方法，維納斯剪順著穿刺點(diǎn)進(jìn)入前房沿角膜緣360°剪下4.0 mm受體角膜植片（可用液氮保存），制作好植床。將供體植片置于受體植床上，見(jiàn)圖2A，使用12-0國(guó)產(chǎn)顯微縫線進(jìn)行間斷縫合8針，線節(jié)不埋藏，前房?jī)?nèi)注入空氣約0.1mL形成前房，見(jiàn)圖2B。術(shù)畢，結(jié)膜下注射慶大霉素注射液0.1 mL，結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)妥布霉素眼膏，6-0縫線縫合眼瞼中部防止術(shù)后大鼠抓撓眼部引起感染。

1.2.3 自體角膜移植（對(duì)照組）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后操作同供體準(zhǔn)備方法，維納斯剪順著穿刺點(diǎn)進(jìn)入前房沿角膜緣360°剪下4.25 mm角膜植片，旋轉(zhuǎn)180°后，見(jiàn)圖3A，使用12-0國(guó)產(chǎn)顯微縫線進(jìn)行間斷縫合8針，線節(jié)不埋藏，其他處理同同種異體角膜移植，見(jiàn)圖3B。

圖3 同種自體角膜移植Fig.3 Autologous corneal transplantation

1.2.4 術(shù)后處理 術(shù)后24 h剪開(kāi)眼瞼縫線，點(diǎn)妥布霉素眼膏，1次/d。術(shù)后體式顯微鏡下觀察并拍照。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后3 d內(nèi)無(wú)植片傷口裂開(kāi)，無(wú)前房、眼內(nèi)感染等并發(fā)癥發(fā)生；術(shù)后1周內(nèi)每日觀察1次，1周后隔日觀察1次，并記錄角膜植片的混濁指數(shù)、水腫指數(shù)及新生血管指數(shù)并評(píng)分，直至術(shù)后14 d取材。

按照Larkin DF[9]的標(biāo)準(zhǔn)，由同一醫(yī)生進(jìn)行排斥反應(yīng)評(píng)分，三項(xiàng)評(píng)分之和為排斥指數(shù)（rejection index，RI），當(dāng)RI≥6，確定為排斥，見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠術(shù)后14 d排斥反應(yīng)評(píng)分，計(jì)量資料用（）表示，用t檢驗(yàn)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Scoring criteria for rejection after corneal transplantation

2 結(jié)果

2.1 角膜植片觀察

實(shí)驗(yàn)組（同種異體角膜移植組）排斥反應(yīng)率較對(duì)照組（自體角膜移植組）顯著增高。

實(shí)驗(yàn)組：共20只大鼠，1只大鼠于術(shù)后1 d死亡，其余19只大鼠術(shù)后第1～3天角膜植片輕度混濁、基質(zhì)水腫，第6～7天切口處出現(xiàn)新生血管，后向植片中心生長(zhǎng)，植片混濁、基質(zhì)水腫逐漸加重，術(shù)后14 d取材，術(shù)眼均發(fā)生排斥反應(yīng)，排斥反應(yīng)指數(shù)均≥6。評(píng)分7分（植片混濁度分4分+植片水腫度2分+植片新生血管度1分=7分），見(jiàn)圖4。排斥反應(yīng)率為100%。對(duì)照組共20只大鼠，術(shù)后第1～3天角膜植片輕度混濁、基質(zhì)水腫，第6～7天混濁及水腫逐漸消退，術(shù)后第14天取材，術(shù)眼植片未出現(xiàn)新生血管，排斥反應(yīng)指數(shù)均＜6。

2.2 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組術(shù)后7 d、14 d角膜植片評(píng)分

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠角膜移植術(shù)后7 d、14 d植片評(píng)分情況，術(shù)后7 d排斥反應(yīng)評(píng)分實(shí)驗(yàn)組為（4.5±0.65）分，對(duì)照組為（4.0±0.25）分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.966，P=0.077 6），術(shù)后14 d排斥反應(yīng)評(píng)分實(shí)驗(yàn)組為（8.5±2.12），對(duì)照組為（3.0±0.32）分經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.871，P=0.0045），見(jiàn)表2。

2.3 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組術(shù)后排斥反應(yīng)指數(shù)對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8 d左右開(kāi)始出現(xiàn)排斥反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、排斥反應(yīng)重。術(shù)后14 d取材，實(shí)驗(yàn)組排斥反應(yīng)評(píng)分為（8.5±2.12）分，對(duì)照組排斥反應(yīng)評(píng)分為（3.0±0.32）分，經(jīng)t檢驗(yàn)，P=0.004 5，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)眼角膜植片排斥圖Fig.4 Exclusion of corneal grafts in rats

表2 兩組大鼠角膜移植術(shù)后7 d、14 d植片評(píng)分情況［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

表2 兩組大鼠角膜移植術(shù)后7 d、14 d植片評(píng)分情況［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

圖5 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組術(shù)后同時(shí)間排斥反應(yīng)指數(shù)折線圖Fig.5 The index line diagram of the experimental group and the control group after operation

3 討論

心臟死亡供體模型多采用小型豬制作，但目前尚無(wú)適用于大鼠的心電監(jiān)測(cè)及呼吸機(jī)設(shè)備可用于實(shí)驗(yàn)，亦未見(jiàn)心臟死亡大鼠模型的建立報(bào)道。本文采用心腔內(nèi)注射空氣直接造成心臟死亡，參考Williams[6]制作大鼠角膜移植的方法制作大鼠心臟死亡供體角膜移植排斥反應(yīng)模型，改進(jìn)了部分造模細(xì)節(jié)、關(guān)鍵步驟及流程。方法簡(jiǎn)單易行，可操作性強(qiáng)。

3.1 減少感染

減少感染，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)菌條件，縮短手術(shù)時(shí)間大鼠角膜直徑約6 mm，前房極淺，晶體呈球形，角膜移植手術(shù)操作難度大，一旦術(shù)后發(fā)生感染將直接造成模型制作失敗，因此保證造模后術(shù)眼不感染是最重要的。大鼠角膜移植過(guò)程中眼內(nèi)容物虹膜晶體等暴露的時(shí)間越長(zhǎng)，術(shù)后感染幾率越大，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需嚴(yán)格無(wú)菌操作以減少術(shù)后感染發(fā)生的幾率。大鼠顱骨解剖特點(diǎn)決定了實(shí)驗(yàn)時(shí)眼部無(wú)法與試驗(yàn)臺(tái)保持平行，視野聚焦不清楚，會(huì)增加眼內(nèi)容物脫出的風(fēng)險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)中研究小組自制的大鼠頭枕可以將大鼠頭部固定牢固且保證眼位，為手術(shù)創(chuàng)造適宜條件，縮短大鼠眼部“開(kāi)窗”時(shí)間，從而減少術(shù)后眼內(nèi)炎發(fā)生幾率。同時(shí)銳利的手術(shù)器械和熟練的操作對(duì)于縮短手術(shù)時(shí)間也非常重要。受體麻醉劑的選擇，目前多選擇使用3%戊巴比妥1.5 mL/kg或10%水合氯醛3.5～4.2 mL/kg[10-11]。本研究選擇10%水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉效果及麻醉深度好，能保證角膜移植手術(shù)順利進(jìn)行。首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院報(bào)道了水合氯醛、烏拉坦、戊巴比妥三種常用麻醉劑對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠麻醉效果觀察，發(fā)現(xiàn)水合氯醛與戊巴比妥比較，麻醉期較長(zhǎng)、誘導(dǎo)期更短，對(duì)心跳呼吸頻率影響更小[12]。

3.2 增加角膜移植排斥幾率

本實(shí)驗(yàn)中角膜移植排斥幾率為100%。影響人眼角膜移植排斥的因素有：受體原發(fā)角膜病變，是否為再次角膜移植，是否為高危角膜移植，角膜植片大小[13-14]。大鼠模型中可控因素為植片大小、縫線、術(shù)后處理。植片大小的選擇文獻(xiàn)報(bào)道大部分為3 mm[15]。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇植片大小，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑楂@取排斥角膜植片進(jìn)一步研究則可選4.25 mm直徑環(huán)鉆，因?yàn)榻悄ぶ财酱?，術(shù)后排斥反應(yīng)幾率越大，4.25 mm直徑植片標(biāo)本體積大，也更利于進(jìn)一步分析。大部分文獻(xiàn)顯示縫線選擇10-0縫線[16]本文中使用國(guó)產(chǎn)12-0尼龍線，對(duì)比進(jìn)口10-0縫線而言，粗細(xì)、韌度相當(dāng)，針尾較10-0縫線粗，優(yōu)勢(shì)是價(jià)格為進(jìn)口縫線的1/20。本研究術(shù)后使用妥布霉素眼膏，術(shù)后未發(fā)生眼內(nèi)炎，術(shù)后10d左右開(kāi)始出現(xiàn)排斥反應(yīng)。既往研究中有使用抗生素眼液+糖皮質(zhì)激素眼膏方案[17]，但具體頻次尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究中術(shù)后每日使用妥布霉素眼膏，操作次數(shù)減少，在保證動(dòng)物模型成功的前提下減少了工作量，術(shù)后使用糖皮質(zhì)激素眼膏可以降低排斥反應(yīng)發(fā)生率，為增加術(shù)后排斥反應(yīng)率可不必使用糖皮質(zhì)激素眼膏，僅用抗生素眼膏，術(shù)后14 d可出現(xiàn)明顯排斥反應(yīng)。

綜上所述，心臟死亡大鼠角膜移植排斥反應(yīng)模型制作的關(guān)鍵步驟為：固定大鼠頭位、麻醉劑的選擇、銳利的手術(shù)器械及熟練的顯微手術(shù)操作技巧，保證在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成手術(shù)，減少術(shù)后感染發(fā)生率；選擇直徑4.25 mm大小植片、12-0國(guó)產(chǎn)尼龍縫線（價(jià)格低廉）、術(shù)后僅使用抗生素眼膏預(yù)防感染。