豬let-7a靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

張家慶，王獻(xiàn)偉，李文嘉,何俊丹，白紅杰，陳俊峰，任巧玲，魏成斌，邢寶松*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2. 河南省畜牧總站,鄭州450008；3 鄭州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450000；4. 河南農(nóng)業(yè)高新技術(shù)集團(tuán)有限公司，鄭州 450002；)

卵泡發(fā)育成熟排卵或閉鎖退化取決于卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的狀態(tài):細(xì)胞增殖分化則成熟排卵, 細(xì)胞凋亡則卵泡閉鎖[1]。豬是多胎動(dòng)物，在其出生前卵巢內(nèi)就含有大量的原始卵泡，但在其繁殖期參與排卵的卵泡數(shù)量?jī)H占初級(jí)卵母細(xì)胞總數(shù)的0.14%，其余均自行退化閉鎖[1-2]。在卵泡期卵巢上約有50%的中等卵泡(3～6 mm)在選擇過程中發(fā)生閉鎖，僅有10～25個(gè)卵泡可發(fā)育至成熟而排卵[3]。因此，卵泡閉鎖是導(dǎo)致排卵率降低的關(guān)鍵因素。目前研究表明，卵泡閉鎖的實(shí)質(zhì)是顆粒細(xì)胞的凋亡，并已證實(shí)有許多基因或轉(zhuǎn)錄因子、生殖激素、細(xì)胞因子等對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡有直接或間接的調(diào)控作用[4]。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為21～23 bp的非編碼RNA，可通過結(jié)合相應(yīng)靶基因的3'UTR來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，具有高度的種間保守性[5]，在細(xì)胞凋亡、自噬、增殖等生物學(xué)進(jìn)程中起著重要功能[6]。miRNA廣泛參與了豬卵泡發(fā)育和閉鎖的調(diào)控過程，如Let-7g可通過靶向作用于MAP3K1從而誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡[7]，miR-378可通過靶向于CYP19基因的表達(dá)來調(diào)控顆粒細(xì)胞中雌二醇的水平[8]，miR-34c可作用于FOXO3來調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的功能[9]。let-7a 是最先被鑒定的miRNA 之一 let-7家族的一員[10]，且在由藥物、感染和應(yīng)激等因素引起的細(xì)胞凋亡中具有重要的抗凋亡作用。但對(duì)于其參與調(diào)控豬卵泡閉鎖的研究還十分欠缺。因此，探索let-7a參與豬卵泡閉鎖的調(diào)控機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用卵巢采自鄭州市惠濟(jì)區(qū)屠宰場(chǎng)，來自體重約為(125±5 kg)的外三元母豬。卵巢的形態(tài)觀察及運(yùn)送方式參照文獻(xiàn)[9]。

1.2 分離有腔卵泡

參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行有腔卵泡(3～5 mm)分離和形態(tài)、質(zhì)量的鑒定，根據(jù)其形態(tài)和質(zhì)量分為健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡3種。

1.3 顆粒細(xì)胞及卵泡液分離

單個(gè)卵泡經(jīng)體式顯微鏡初步鑒定后，使用本課題組發(fā)明的一種裝置(專利號(hào)ZL201720410245.0)分離不同類型卵泡內(nèi)的卵泡液和顆粒細(xì)胞，分離后立即液氮凍存，然后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 生殖激素的測(cè)定

單個(gè)卵泡液內(nèi)生殖激素的測(cè)定使用豬特異性的孕酮和雌激素ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，檢測(cè)前分別使用生理鹽水將單個(gè)卵泡液進(jìn)行50倍稀釋，稀釋混勻后再分別進(jìn)行E2和P4的濃度測(cè)定。

1.5 熒光定量PCR

1.6 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1.6.1 顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 將采集的顆粒細(xì)胞1 000 r/min 離心5 min去除卵泡液；用預(yù)熱的PBS (37 ℃) 洗滌2次，每次1 000 r/min 離心5 min，去除PBS；用1 mL含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和雙抗的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸顆粒細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12～24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，未貼壁的顆粒細(xì)胞更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代，用于后續(xù)相關(guān)研究。

1.6.2 轉(zhuǎn)染 將上述豬顆粒細(xì)胞消化混勻?yàn)?1～1.5)×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取0.2 mL細(xì)胞懸液分別加入96孔板內(nèi)，培養(yǎng)6～12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染(此時(shí)培養(yǎng)基不含雙抗)，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書。分為3組，即空白對(duì)照組(Blank，未轉(zhuǎn)染組)、陰性對(duì)照組( NC，空載體轉(zhuǎn)染組)和轉(zhuǎn)染let-7a mimics組。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，引物序列如下：

ssc-let-7a sense：5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'

ssc-let-7a antisense：5'-CUAUACAACCUACUACCUCAUU-3'

NC sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3'

NC antisense：5'-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3'

1.6.3 H2O2處理 試驗(yàn)分成空白對(duì)照組(Blank)、 H2O2組(Blank+H2O2)、陰性對(duì)照組(NC)和let-7a組(轉(zhuǎn)染let-7a mimics)4個(gè)組，轉(zhuǎn)染48 h后，除Blank組外，其余3組均用150 μmol/L H2O2處理6 h，收集部分樣品用于RNA提取和定量分析，部分樣品用于細(xì)胞活性檢測(cè)。

1.6.4 MTT檢測(cè) H2O2處理6 h后，利用MTT試劑盒(南京建成生物工程研究所)處理細(xì)胞，每孔的吸光度測(cè)定采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀進(jìn)行，波長(zhǎng)設(shè)定為570 nm，細(xì)胞的增殖率與測(cè)定的吸光度成正比。

1.7 ssc-let-7a生物信息學(xué)分析

1.7.1 TFBS預(yù)測(cè) 利用NCBI和ensembl數(shù)據(jù)分別檢索ssc-let-7a前體(ssc-let-7a-1和ssc-let-7a-2)，分別取其上游2 kb的堿基序列，然后分別應(yīng)用PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3),JASPAR CORE Vertebrate (http://jaspardev.genereg.net/) 生物信息在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)ssc-let-7a 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。

1.7.2 物種間保守性分析 利用miRBase (Rlease 21，http://www.mirbase.org/) 分別查出豬(Susscrofa, Ssc)、人(Homosapiens, Hsa)、大鼠(Rattusnorvegicus, Rno)、小鼠(Musmusculus, Mmu)、灰倉(cāng)鼠(Cricetulusgriseus, Cgr)、牛(Bostaurus, Bta)、馬(Equuscaballus, Eca)、大猩猩(Gorillagorilla, Ggo)、婆羅州猩猩(Pongopygmaeus, Ppy)、黑猩猩(Pantroglodytes, Ptr)和 獼猴 (Macacamulatta, Mml)的ssc-let-7a成熟序列，并分析各物種間的保守性。

1.7.3 靶基因分析 為分析ssc-let-7a的生物學(xué)功能，分別使用TargetScan、miRanda、RNAhybrid 三款軟件對(duì)ssc-let-7a進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)；根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果交集，結(jié)合近年來已發(fā)表的與ssc-let-7a相關(guān)研究，確定其靶基因并進(jìn)行后續(xù)分析。

1.7.4 GO富集性分析 利用數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)最新豬的注釋信息，運(yùn)用BINGO對(duì)其ssc-let-7a靶基因的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分進(jìn)行注釋分析；應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，以P≤0.05為閾值，獲得顯著富集的GO term。

1.7.5 KEGG富集性分析 利用ClueGO(Cytoscape 插件)進(jìn)行ssc-let-7a的KEGG通路富集分析，利用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，以P≤0.05為閾值，獲得顯著富集的KEGG通路。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR采用GAPDH基因作為內(nèi)參，miRNA的定量利用U6作為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)分析按照2-△△Ct方法進(jìn)行[12]。利用SPSS 17.0中 one-wayANOVA分析方法對(duì)基因表達(dá)量化進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，P<0.05 定為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形態(tài)卵泡中E2和P4濃度的變化

早期和晚期閉鎖卵泡中E2的濃度顯著低于健康卵泡(圖1A)；P4的水平變化呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(圖1B)，即早期和晚期閉鎖卵泡中的水平顯著高于健康卵泡(P<0.05)。當(dāng)有腔卵泡開始出現(xiàn)輕微閉鎖時(shí)，E2在卵泡液中的水平開始下調(diào)；而卵泡液中P4的水平開始上調(diào)，P4/E2之比值與卵泡閉鎖程度呈正相關(guān) (圖1C)。

2.2 ssc-let-7a在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量變化

qRT-PCR檢測(cè)了ssc-let-7a 在健康卵泡、早期閉鎖和晚期閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示，隨著卵泡閉鎖程度的加深，ssc-let-7a表達(dá)量逐漸降低，故推測(cè)ssc-let-7a可能顆粒細(xì)胞凋亡中起著抗凋亡作用，它的低轉(zhuǎn)錄水平可能促進(jìn)了顆粒細(xì)胞凋亡，加速了卵泡閉鎖的進(jìn)程。

2.3 過表達(dá)ssc-let-7a對(duì)H2O2誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

MTT結(jié)果分析表明，與空白對(duì)照組(Blank)相比，H2O2處理組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；與陰性對(duì)照(NC)相比較，過表達(dá)ssc-let-7a可部分抑制H2O2對(duì)顆粒細(xì)胞活力的影響(P<0.05)(圖3)。與Blank相比，H2O2處理組凋亡相關(guān)基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與NC相比較，過表達(dá)ssc-let-7a可部分抑制H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒凋亡相關(guān)基因的表達(dá)(P<0.05)(圖4)，說明過表達(dá)ssc-let-7a對(duì)H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

2.4 TFBS分析結(jié)果

運(yùn)用2種生物信息分析軟件對(duì)ssc-let-7a的前體(見表1)啟動(dòng)子上游2kb區(qū)域進(jìn)行了TFBS預(yù)測(cè)，結(jié)果表明其啟動(dòng)子區(qū)域具有叉頭轉(zhuǎn)錄因子1 (Foxo1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子3(Foxo3)、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3 (Foxp3) 、叉頭轉(zhuǎn)錄因子4(Foxo4)、p53轉(zhuǎn)錄因子、激活子蛋白-1(activatorprotein1,AP-1)、核因子B (Nuclear factor kappa B, NFkB)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 (Signal transducers and activators of transcription，STAT)、轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子 (HLTF)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)、Smad4、轉(zhuǎn)錄因子Sp1(specificity protein1，Sp1)等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中Foxo1、Foxo3、p53、NFkB等均參與了豬顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)(圖5)。

圖4 過表達(dá)ssc-let-7a對(duì)顆粒
細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響
Fig.4 Effects of ssc-let-7a over-expression on the
expression of apoptosis-related genes in granulosa cells

表1 豬let-7a前體的詳細(xì)信息Table 1 The details of the pig let-7a precursors

2.5 let-7a保守性分析

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase搜索了包括豬在內(nèi)的總共11個(gè)物種let-7a成熟區(qū)序列，具體結(jié)果見表2，各物種間let-7a的成熟序列具有高度保守性。

2.6 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

取TargetScan、miRanda和RNAhybrid 三款軟件對(duì)ssc-let-7a靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)中報(bào)道的靶基因，總共獲得278個(gè)基因，作為后續(xù)GO和KEGG分析的靶基因集合(表3)。

2.7 GO富集結(jié)果

對(duì)豬let-7a預(yù)測(cè)的靶基因分別進(jìn)行功能注釋和相應(yīng)的富集處理，如表4～表6和圖4所示，豬let-7a靶基因主要富集于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體正調(diào)控、葡萄糖反應(yīng)、蛋白穩(wěn)定性調(diào)控和內(nèi)皮細(xì)胞遷移等多個(gè)生物學(xué)過程(P<0.05)；在細(xì)胞組分層面，靶基因顯著富集于內(nèi)體膜的外部組件、中間體和質(zhì)膜外側(cè)面等相關(guān)的GO條目中(P<0.05)；在分子功能層面，靶基因主要富集于蛋白結(jié)合、內(nèi)切酶活性和真核細(xì)胞表面結(jié)合等相關(guān)的GO條目中(P<0.05)。

表2 各物種間let-7a成熟區(qū)序列Table 2 The mature sequence of let-7a among species

表3 豬let-7a靶基因的部分成員Table 3 Some members of the target genes of pig let-7a

表4 豬let-7a靶基因的生物學(xué)過程(BP)Table 4 The biological process of pig let-7a target genes

表5 豬let-7a靶基因的分子功能(MF)Table 5 The molecular function of pig let-7a target genes

表6 豬let-7a靶基因的細(xì)胞組分(CC)Table 6 The cellular component of pig let-7a target genes

2.8 KEGG富集分析

為探明豬let-7a的生物學(xué)功能，采用ClueGO對(duì)上述預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行相關(guān)通路富集，如圖7所示，ssc-let-7a靶基因顯著富集于RIG-I樣受體信號(hào)通路、ECM受體相互作用、溶酶體、細(xì)胞因子受體相互作用、胞質(zhì)DNA傳感通路、MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路。

3 討 論

Let-7a是Let-7家族重要成員之一。隨著研究的不斷深入，眾多研究已證實(shí)Let-7a在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化與凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10,14]。但目前對(duì)Let-7a在豬卵泡閉鎖中的時(shí)空表達(dá)機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中Let-7a的表達(dá)量與卵泡閉鎖程度成反比。健康卵泡、早期閉鎖和晚期閉鎖中顆粒細(xì)胞的表達(dá)量變化趨勢(shì)說明Let-7a與卵泡發(fā)育和閉鎖有著極為重要的關(guān)聯(lián)。E2和P4的水平對(duì)于調(diào)控卵泡發(fā)育和閉鎖起關(guān)鍵調(diào)控作用，卵泡液中E2和P4濃度的改變能夠表明有腔卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的生理狀況[15]；P4 /E2比值與細(xì)胞內(nèi)核酶的活性呈正相關(guān)，其比值能夠客觀地評(píng)判卵泡閉鎖的程度[16]。本研究結(jié)果顯示早期和晚期閉鎖卵泡中E2的濃度顯著低于健康卵泡，P4的水平變化呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，而P4 /E2之比值與卵泡閉鎖程度呈正相關(guān)。由此可推測(cè)類固醇激素表達(dá)水平的變化可能會(huì)直接或間接下調(diào)Let-7a的表達(dá)量，這也說明了 Let-7a 的表達(dá)水平對(duì)于E2和P4調(diào)控豬卵泡發(fā)育和閉鎖可能存在重要的影響。

目前有關(guān) Let-7a的報(bào)道主要集中在人類及小動(dòng)物細(xì)胞。例如，在犬流感病毒感染的犬腎細(xì)胞中Let-7a作為一種抗凋亡因子起著抗凋亡作用，過表達(dá)Let-7a則能夠有效地抑制病毒誘導(dǎo)的凋亡，而抑制其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。Yu等[18]證實(shí)Let-7a可同時(shí)靶向Fas和FasL 的3'UTR，通過抑制Let-7a表達(dá)可上調(diào)Fas和FasL蛋白水平，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。Tsang等[19]發(fā)現(xiàn)在人類癌細(xì)胞中Let-7a靶向caspase-3從而調(diào)控藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Song等[20]則發(fā)現(xiàn)在人支氣管上皮細(xì)胞暴露PM2.5后，過表達(dá)Let-7a能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平和凋亡細(xì)胞比率。卵泡閉鎖的實(shí)質(zhì)是顆粒細(xì)胞凋亡，而氧化應(yīng)激是誘發(fā)其凋亡的重要因素[13]。H2O2是一種常用的氧化劑，廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡，對(duì)ssc-let-7a在不同類型有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，并研究了其在正常發(fā)育顆粒細(xì)胞中的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中過表達(dá)ssc-let-7a能夠有效地抑制H2O2誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，表明過表達(dá)ssc-let-7a能夠?qū)诡w粒細(xì)胞的氧化損傷，由此可推測(cè)Let-7a在豬顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖中可能起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

miRNA對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜又精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞自噬、凋亡、增殖和分化等生物學(xué)進(jìn)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[10]。為揭示 Let-7a在豬卵泡閉鎖中的作用，本研究對(duì)三款軟件預(yù)測(cè)的交集靶基因進(jìn)行GO和KEGG相關(guān)分析。Let-7a靶基因的GO注釋主要顯著富集在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體正調(diào)控、葡萄糖反應(yīng)、參與凋亡半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程，由此推測(cè)Let-7a在豬卵泡閉鎖中發(fā)揮重要作用。KEGG富集結(jié)果顯示，Let-7a靶基因顯著富集在細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號(hào)通路、TGF-β等信號(hào)通路。在預(yù)測(cè)的候選靶基因中，3個(gè)靶基因和細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系，它們分別是TP53、FAS和CASP3，其主要參與MAPK信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等細(xì)胞凋亡密切相關(guān)通路。Fas 配體受體系統(tǒng)在豬顆粒細(xì)胞凋亡中起著重要的作用[21]，F(xiàn)AS/FASL的結(jié)合能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在宮頸癌研究中，Wang等[24]證實(shí)let-7/miR-98可靶向于FAS，而過表達(dá)miR-98可下調(diào)FAS的表達(dá)從而抑制了凋亡過程。Yu等[18]研究表明Let-7a靶向Fas的3'UTR，抑制Let-7a可上調(diào)Fas蛋白水平，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。CASP3是Caspase家族成員中的關(guān)鍵執(zhí)行成員，它在內(nèi)外界因素介導(dǎo)的凋亡途徑中起著關(guān)鍵作用。例如，在癌細(xì)胞中過表達(dá)Let-7a可下調(diào)CASP3的表達(dá)，抑制Let-7a表達(dá)可促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡，而應(yīng)用CASP3抑制劑可阻止凋亡發(fā)生[19]。據(jù)此推測(cè)，let-7a可能靶向于CASP3和FAS調(diào)控其在豬顆粒細(xì)胞中表達(dá)變化繼而調(diào)控相應(yīng)的凋亡通路，這為后續(xù)深入研究其對(duì)豬卵泡閉鎖調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制提供了重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過研究分析let-7a在不同形態(tài)的豬卵泡顆粒中的表達(dá)量變化，初步明確了let-7a對(duì)豬顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖的可能調(diào)控機(jī)制。通過體外培養(yǎng)及處理研究發(fā)現(xiàn)，在豬顆粒細(xì)胞中過表達(dá)let-7a能夠有效地抑制H2O2誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。通過靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)let-7a靶基因相關(guān)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，let-7a可靶向于凋亡相關(guān)基因CASP3和FAS, 因此推測(cè)let-7a對(duì)豬顆粒細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用很可能是通過靶向CASP3和FAS，繼而參與了豬卵泡發(fā)育和閉鎖的調(diào)控。