一種河北塊菌的鑒定和抗氧化活性研究

楊金鳳 張 婷 李 潔

（河北民族師范學院 生物與食品科學系，河北 承德 067000）

塊菌（Truffles）是一類呈塊狀的地下真菌的通稱，包括真塊菌、假塊菌和豆塊菌[1]63-67三個不同的科屬。常生長于鈣質(zhì)的土壤中，多與針葉樹和闊葉樹植物的根系共生，形成外生菌根[2]。我國的塊菌主要分布于云南、四川、新疆和西藏等地，此外在河北、山西、湖南、吉林、甘肅、遼寧、北京、福建、湖北和臺灣等地均有少量分布[3]1560-1565。塊菌大多數(shù)是以宏觀特征如子實體和子囊孢子的形態(tài)特征來進行區(qū)分，但在區(qū)分兩個形態(tài)比較相似或親緣關系較近的種時會遇到難題[4]6-10，而分子生物學的應用克服了傳統(tǒng)形態(tài)學觀察的缺點，為生物種屬的確定提供了可靠的證據(jù)。

塊菌又被稱為“豬拱菌”，其營養(yǎng)豐富，氣味芬芳。富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)以及不飽和脂肪酸等生理活性成分及多樣性的微量元素，具有抗氧化、抗突變、抑菌、保肝、抗癌和抗炎等廣泛的生物活性[5]465-472，且抗氧化能力比其它食用菌高[6]2567-2581。本研究對河北野生白塊菌和云南黑塊菌抗氧化能力進行初步研究，以期為河北塊菌的開發(fā)和利用提供一定的理論基礎。

1 試驗材料

河北白塊菌，采自河北省承德市雙橋區(qū)普寧寺后山；云南黑塊菌，采自云南怒江自治州貢山縣丙中洛鎮(zhèn)。

2 試驗方法

2.1 塊菌形態(tài)觀察

2．1．1 外部形態(tài)觀察

肉眼觀察河北白塊菌子實體的形狀、大小、顏色，子囊果表面有無疣突或被絨毛或微絨毛等結(jié)構(gòu)。

2．1．2 解剖結(jié)構(gòu)觀察

橫切面觀察：菌脈的排列情況、顏色，產(chǎn)孢組織的顏色、質(zhì)地等；

顯微結(jié)構(gòu)觀察：采用徒手切片法制成塊菌子實體臨時裝片，觀察孢子囊的大小、形狀、顏色以及孢子的數(shù)目、大小、形狀和表面紋飾等。

2.2 塊菌分子生物學水平鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取河北白塊菌基因組DNA，以通用引物

18S1(CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA)18S2(CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT)進行擴增。擴增體系模板1μL，2×Master Mixture 12.5μL，18S1/18S2引物各1μL，加ddH2O補足至25μL。擴增程序：94℃預變性4 min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35 個循環(huán)，72℃平展10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并將產(chǎn)物送至上海生工進行雙向測序。

2.3 塊菌提取物的制備

參照郭坦等[5，7-9]塊菌提取物的制備方法稍作修改。準確稱取干燥的塊菌菌粉20．000g加入800mL55%的乙醇，浸泡48h后超聲提取30min，8000rpm離心5min，取上清液旋蒸至無醇味，加入等體積的石油醚萃取，靜置分層，將各層得到的粗提物濃縮，定容至20mL，4℃避光保存，備用。

2.4 塊菌提取物抗氧化活性測定

2．4．1 總抗氧化能力的測定

總抗氧化能力的測定參照延莎等[10-13]的方法稍作修改。取0．2mL待測樣品加入0．6mL的28mmol/L磷酸鈉溶液、4mmol/L鉬酸銨溶液和0．6mol/L硫酸溶液，混勻后于95℃水浴90min，以溶劑作為空白對照，冷卻后在695nm處測定吸光度值，并以VC標準品測定總抗氧化能力標準曲線，計算塊菌提取物相對于VC的濃度。

2．4．2 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照張婷等[10，14]方法適當修改。取待測樣品500μL，加入DPPH自由基溶液6mL，并加入無水乙醇補足至10mL，以溶劑作對照，在517nm下測量各樣品吸光度值A樣品，計算各樣品DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[(A對照-A樣品)/A對照]×100%

2．4．3 羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除能力的測定參照張新國等[15-18]的方法。取1．0mL各待測提取物，依次加入1．0mL9．0mmol/L硫酸亞鐵、1．0mL9．0mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1．0mL8．8mmol/LH2O2，迅速混勻，37℃恒溫30min，于510nm波長下測定其吸光度值Ax，以VC作為陽性對照，以溶劑作為空白對照A0；以蒸餾水代替9．0mmol/L的水楊酸-乙醇溶液作為樣品對照Ab。計算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[A0-(Ax-Ab)]/A0×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 生長環(huán)境與形態(tài)學特征

河北白塊菌生長于土壤干燥且通氣良好的山坡地，其周圍生長有各種草本植物、灌木以及喬木，河北白塊菌在土壤下2～30厘米處與植物的根共生（圖1）。子囊果地下生，整體形狀近似球形，顏色為白黃色至黃褐色，子囊果外覆蓋有白色菌絲，表面凹凸不平有內(nèi)陷的小孔，表面光滑或稍粗糙，無疣突，成熟的塊菌表面有龜裂（圖2）。

圖1 河北白塊菌生長環(huán)境

圖2 塊菌外部形態(tài)結(jié)構(gòu)

如圖3-a所示塊菌子實體產(chǎn)孢組織黃褐色，成熟后形成空腔向內(nèi)凹陷，菌脈白色，呈大理石紋理樣，菌脈貫穿整個子囊果。由3-b可以看出產(chǎn)孢細胞呈不規(guī)則狀散亂分布，子囊在產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列，3-c、d顯示子囊呈球形至橢圓形或圓柱狀至棒狀，無色透明，每個子囊內(nèi)包含有8個子囊孢子，子囊孢子呈球狀，黃色至黃褐色，孢子表面具有明顯的鈍刺；顯微鏡下能明顯看到其菌脈紋理結(jié)構(gòu)。

3.2 塊菌分子生物學鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物大小約為1500 bp（圖4）。M為DL2000，1為陰對照，2、3為河北白塊菌。

圖4 PCR電泳圖

將測序結(jié)果進行序列拼接后與NCBI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，與編號為AJ305045．1的地菇狀馬蒂奧洛塊菌18SrDNA區(qū)段的DNA序列同源性達100%，兩者對比的Max score值為1144，堿基覆蓋率達96%。結(jié)合形態(tài)學特征，確定該河北白塊菌屬于地菇狀馬蒂奧洛塊菌（Mattirolomyces terfezioides）。

3.3 塊菌提取物抗氧化活性分析

3．3．1 總抗氧化能力

按照2．4．1測定總抗氧化能力的方法，繪制VC標準品總抗氧化能力標準曲線，結(jié)果如圖5。

圖5 VC總抗氧化能力標準曲線

測定各層塊菌提取物的總抗氧化能力，根據(jù)標準曲線方程計算出各層提取物相對于VC標準品的濃度(mg/mL)，結(jié)果如表1所示。

表1 塊菌提取物總抗氧化能力

由表1可知，河北白塊菌水層提取物的總抗氧化活性最強，其次是乙醇層提取物，石油醚層提取物的總抗氧化能力最低。每毫升1g河北白塊菌的水層提取物的總抗氧化能力相當于14．4225mg/mL的VC標準品，是云南黑塊菌水層提取物總抗氧化能力的2．29倍；河北白塊菌乙醇層提取物的總抗氧化能力是云南黑塊菌的2．31倍。

3．3．2 DPPH自由基清除能力

將水層提取物稀釋10倍，乙醇層和石油醚層提取物均未稀釋，測定各層塊菌提取物的DPPH自由基清除率，結(jié)果如表2所示。含0.1g塊菌的提取物；乙醇層和石油醚層提取物未稀釋，為每毫升含1g塊菌的提取物。

表2 DPPH自由基清除能力

由表2可知，河北白塊菌和云南黑塊菌提取物都有一定的DPPH自由基清除能力，其中河北白塊菌水層提取物的DPPH清除能力最高，達51．90%，顯著高于黑塊菌水層提取物；石油醚層提取物的最低；河北白塊菌乙醇層提取物DPPH清除能力也明顯高于云南黑塊菌，原因可能是河北白塊菌乙醇層提取物中含有較多具有抗氧化活性的物質(zhì)。

3．3．3 羥自由基清除能力

將水層提取物稀釋100倍，乙醇層和石油醚層提取物稀釋10倍，測定各層塊菌提取物的羥自由清除率，結(jié)果如表3所示。

表3 羥自由基清除能力

由表3可知，兩種塊菌水層提取物的羥自由基清除能力最高，并且河北白塊菌水層提取物清除能力明顯高于云南黑塊菌，與100μg/mLVC標準品清除羥自由基能力相比，河北白塊菌水層提取物是其1．49倍，云南黑塊菌是其1．13倍；二者乙醇層提取物羥自由基清除能力無顯著差異，石油醚層提取物幾乎無羥自由基清除能力。

4 結(jié)論與討論

本試驗通過對河北白塊菌和云南黑塊菌三種不同提取物的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力進行研究發(fā)現(xiàn)：兩種塊菌水層提取物的抗氧化活性均為最強，推測可能是水層提取物中含有較多的多糖類等水溶性物質(zhì)。為了驗證這一點，試驗中對兩種塊菌水層提取物多糖含量進行了測定，其中河北白塊菌多糖含量為16．54mg/g，云南黑塊菌多糖含量為4．28mg/g，初步認為塊菌多糖含量與其抗氧化活性之間呈現(xiàn)一定的對應關系，這與前人研究食用菌多糖具有抗氧化功效的結(jié)果一致[19-20]。乙醇層提取物和石油醚層提取物抗氧化能力較低可能是溶于乙醇和石油醚的抗氧化物質(zhì)較少。因此，對于塊菌提取物的生物活性成分、含量以及與抗氧化活性之間的關系有待于進一步的研究。本實驗只對塊菌提取物的抗氧化活性進行了初步的研究，對于提取物的制備條件還有待于進一步的優(yōu)化。同時可對不同塊菌提取物進行體內(nèi)抗氧化能力研究，以期為其功能開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。