山東濟(jì)寧騷擾庫蚊對常用殺蟲劑的抗性研究

王 洋，楊琳琳，楊秋蘭，劉宏美，宋 曉，程 鵬，王海防，王海洋，王懷位，劉麗娟，郭秀霞，張崇星，趙玉強(qiáng)，公茂慶

騷擾庫蚊(Culexpipiensmolestus)屬于庫蚊屬(GenusCulex)、庫蚊亞屬(SubgenusCulex)、尖音庫蚊復(fù)合組(Cx.pipiensComplex)，在我國此復(fù)合組還包括尖音庫蚊指名亞種(Cx.pipienspipiensLinnaeus，1758)、致倦庫蚊(Cx.pipiensquinquefasciatusSay，1823)、淡色庫蚊(Cx.pipienspallensCoquillett，1898)。騷擾庫蚊屬于自育性蚊蟲，即雌蚊在不吸血的情況下也能進(jìn)行卵黃生成的過程，并可成功產(chǎn)卵。蚊蟲的自育現(xiàn)象首先在尖音庫蚊[1](Cx.pipiens)中被發(fā)現(xiàn)，此后相繼證明騷擾庫蚊[2]、白紋伊蚊[3](Aedes.albopictus)、三帶喙庫蚊[4](Cx.tritaeniorhynchus)等也存在自育現(xiàn)象。騷擾庫蚊主要分布于西歐、中歐、北非、蘇丹、澳大利亞及北美等地[5]。在我國，北京、遼寧、內(nèi)蒙古、上海、湖北[6-7]等地均有記錄。本文在進(jìn)行濟(jì)寧地區(qū)淡色庫蚊抗藥性調(diào)查時，將采集的幼蟲帶回實(shí)驗(yàn)室培育，發(fā)現(xiàn)蚊蟲具有自育性，經(jīng)初步形態(tài)學(xué)鑒定確定為騷擾庫蚊。因此，我們進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定確定濟(jì)寧地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)騷擾庫蚊，并對其進(jìn)行多種殺蟲劑抗性水平的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1野外種群 2018年6月從濟(jì)寧市某小區(qū)半地下車庫積水中采集庫蚊幼蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至羽化，成蚊僅給予5%糖水喂食，不喂食血液而自育性產(chǎn)卵傳代飼養(yǎng)。敏感品系：騷擾庫蚊研究較少，無敏感品系存在，因此，我們選用山東省寄生蟲病防治研究所常規(guī)飼養(yǎng)的淡色庫蚊敏感品系作為參考。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃、光周期：14 L∶10 D、相對濕度(70±10)%。

1.1.2主要儀器與試劑 儀器：SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度計(jì)(美國Molecular Devices)；DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)；Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。試劑：DNeasyBlood & Tissue Kit(德國Qiagen)；PrimeSTARHS DNA Polymerase(大連TaKaRa)；E.Z.N.A.MicroElute Gel Extraction Kit(美國Omega Bio-tek)。殺蟲劑：DDVP(93%，油劑)、殘殺威(96%，粉劑)、氯氰菊酯(95%，油劑)、溴氰菊酯(98%，粉劑)為上海?？祷び邢薰旧a(chǎn)；蘇云金桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensisisraelensis，Bti)(600 IU/mg，顆粒劑)，由山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 隨機(jī)挑選一定數(shù)量的騷擾庫蚊雄蚊尾器制作成標(biāo)本進(jìn)行鑒定[6]。將標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)尾器中陽莖內(nèi)葉、中葉的相對位置和形態(tài)特征進(jìn)行種類比對和鑒定。

1.2.2PCR實(shí)驗(yàn) 采用DNeasyBlood & Tissue Kit進(jìn)行蚊蟲DNA提取，SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度計(jì)測量提取樣品的DNA濃度。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)特異性引物F(5′-GATCCTAGCAAGCGAGAAC-3′)和R(5′-CCCTCCAGTAAGGTATCAAC-3′)PCR擴(kuò)增騷擾庫蚊CQ11基因片段，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系(50 μL)：5× PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃退火15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀讀取結(jié)果。用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化目的基因片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blast比對分析。

1.2.3騷擾庫蚊抗性測定 幼蟲浸漬法[9]，分別測試騷擾庫蚊現(xiàn)場種群以及淡色庫蚊敏感品系對DDVP、殘殺威、氯氰菊酯、溴氰菊酯、Bti 5種殺蟲劑的敏感性。隨機(jī)選取孵化飼養(yǎng)至III齡末IV齡初的幼蟲為測試對象，將待測的5種殺蟲劑原液首先配制成母液，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定藥液的系列濃度范圍，進(jìn)而稀釋成5個不同的系列濃度。實(shí)驗(yàn)組：將25只幼蟲放入盛有100 mL不同系列濃度藥液的白瓷碗中，每種藥液各濃度重復(fù)3次。以丙酮作為對照組，觀察并記錄現(xiàn)場種群以及敏感品系幼蟲接觸藥液24 h后的死亡數(shù)(用玻璃棒輕輕觸動幼蟲，以之無移動或呈痙攣狀態(tài)視為死亡)。根據(jù)每一濃度對應(yīng)的蚊蟲死亡率，將藥液劑量取對數(shù)、蚊蟲死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位進(jìn)行回歸分析，求出半數(shù)致死濃度(LC50)值。若對照組死亡率大于20%，則該實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)作廢。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 測定結(jié)果用SPSS19.0軟件計(jì)算每種藥液LC50值、毒力回歸方程、95%置信區(qū)間(95%CI)及抗性倍數(shù)(RR)。

1.2.5結(jié)果判定 RR=野外種群LC50/敏感品系LC50，RR≥20，為高度抗性；10≤RR<20，為中度抗性；2≤RR<10，為低度抗性；RR<2，為敏感。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)鑒別 騷擾庫蚊雄蚊尾器陽莖側(cè)板腹內(nèi)葉外伸部分細(xì)短而呈鉤狀，背中葉末端平齊，而本地區(qū)常見的淡色庫蚊雄蚊尾器陽莖側(cè)板腹內(nèi)葉外伸部分寬而呈葉狀，背中葉末端平齊或圓鈍[10-11](見圖1)。

圖1 騷擾庫蚊與淡色庫蚊尾器特征(圖片來源文獻(xiàn)[11])Fig.1 Morphological character of the genital is between Culex pipiens molestus and Culex. pipiens pallens

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及核苷酸序列分析 經(jīng)1%的瓊脂糖電泳得到約250 bp左右的目的片段，與理論大小相符(圖2)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast比對，與數(shù)據(jù)庫中騷擾庫蚊CQ11基因相似性為96%(圖3)。

2.2騷擾庫蚊抗性測定 濟(jì)寧市騷擾庫蚊幼蟲對5種常用殺蟲劑LC50分別為DDVP 11.311 7 mg/L、殘殺威5.859 9 mg/L、氯氰菊酯0.022 7 mg/L、溴氰菊酯0.014 0 mg/L、Bti 6.963 8 mg/L，均表現(xiàn)為不同程度的抗藥性(表1)。根據(jù)抗藥性水平判斷標(biāo)準(zhǔn)可知，濟(jì)寧市騷擾庫蚊幼蟲對其中4種殺蟲劑(DDVP、殘殺威、氯氰菊酯、溴氰菊酯)達(dá)到了高度抗性(抗性倍數(shù)分別為117.34、53.47、113.50、140.00)，而對Bti為低度抗性(抗性倍數(shù)為2.71)。

M為DNA標(biāo)志物(DL 2000)；1為騷擾庫蚊CQ11基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2 基因片段擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of gene fragment amplification

圖3 基因片段核苷酸相似性比較Fig.3 Comparison of nucleotide similarity of gene fragments

表1 騷擾庫蚊對5種殺蟲劑的抗藥性狀況
Tab.1 Resistance ofCulexpipiensmolestusto five insecticides

殺蟲劑試蟲來源LC50 (mg/L)回歸方程y=(a+bx)95%CI (mg/L)RRDDVP地下車庫11.311 7y=3.821 3+1.118 8x2.520 4～50.766 4117.34敏感品系0.096 4y=5.890 5+0.876 4x0.052 9～0.175 71.00殘殺威地下車庫5.859 9y=4.419 2+0.756 4x0.658 0～52.187 853.47敏感品系0.109 6y=6.248 5+1.300 5x0.072 1～0.166 61.00氯氰菊酯地下車庫0.022 7y=6.786 6+1.086 4x0.016 1～0.032 0113.50敏感品系0.000 2y=5.931 5+1.313 1x0.000 1～0.000 21.00溴氰菊酯地下車庫0.014 0y=6.506 6+0.812 6x0.008 7～0.022 6140.00敏感品系0.000 1y=5.845 3+0.912 0x0.000 1～0.000 21.00Bti地下車庫6.963 8y=4.162 6+0.993 5x3.671 2～13.209 82.71敏感品系2.573 4y=4.311 2+1.678 0x1.983 0～3.339 41.00

3 討 論

濟(jì)寧地區(qū)生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，適宜多種蚊蟲孳生。隨著濟(jì)寧城市化水平的明顯提高，各種地下基礎(chǔ)設(shè)施(住宅小區(qū)地下室、地下商業(yè)街、地下車庫、污水管網(wǎng))建設(shè)規(guī)模逐漸增大，蚊蟲的棲息場所和行為受到了很大的影響。本研究首次在山東濟(jì)寧地區(qū)發(fā)現(xiàn)了騷擾庫蚊孳生場所，并對騷擾庫蚊進(jìn)行了抗性水平評價。

騷擾庫蚊與淡色庫蚊形態(tài)非常相似但是生物學(xué)行為不同，其特點(diǎn)為具有自育性，可在有限的空間內(nèi)交配，缺乏冬季滯育，喜嗜人血，主要生活在封閉或半封閉的地下環(huán)境中[12]。有研究表明，騷擾庫蚊在不補(bǔ)血的情況下維持10代后，其產(chǎn)卵率并不會下降，可以持續(xù)維持專性自育，而且在同一實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的不同種群的騷擾庫蚊在自育性、繁殖力、生命周期等生活史特征上表現(xiàn)也不同，這些差異可能和騷擾庫蚊與同域亞種的基因交換引起的遺傳差異有關(guān)[11]。本次蚊蟲收集地點(diǎn)的孳生水體位于半地下車庫，其與車庫外部空間無直接接觸，整體相對封閉，適宜騷擾庫蚊孳生。Gao Q等[13]曾報道過上海地區(qū)騷擾庫蚊在尖音庫蚊復(fù)合組的比例，露天地上環(huán)境可達(dá)到30%，而在地下棲息地(地下車庫)的部分地點(diǎn)騷擾庫蚊構(gòu)成比可達(dá)到100%[14]。張杰等[15]發(fā)現(xiàn)上海市楊浦區(qū)的全封閉型小空間地下車庫內(nèi)的蚊蟲均為騷擾庫蚊，全封閉型大空間地下車庫內(nèi)，騷擾庫蚊的比例可達(dá)54.09%，而在半封閉型地下車庫環(huán)境中，騷擾庫蚊數(shù)量較少。因此，他們認(rèn)為地下車庫內(nèi)的蚊種與其孳生水體的密閉程度有關(guān)，越密閉則騷擾庫蚊的比例越高，反之，淡色庫蚊和致倦庫蚊的比例增高。

研究表明，騷擾庫蚊作為西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)的傳播媒介，其特殊的生物學(xué)行為使其能夠在冬季存活下來。WNV通常在鳥類和蚊子間循環(huán)傳播，人主要通過被蚊蟲叮咬而感染。WNV傳入北美后的嚴(yán)峻的流行形勢，突顯了外來的蟲媒病毒對本地區(qū)潛在的公共衛(wèi)生威脅，冬季存活下來并且攜帶病毒的騷擾庫蚊可能為春季北美西尼羅熱疫情快速蔓延的關(guān)鍵因素[14,16]。中國新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)尖音庫蚊體內(nèi)有WNV的存在及WNV造成的相關(guān)病毒性腦炎的流行[17]，而且我國存在著大量可以攜帶WNV的蚊類，全球候鳥遷徙的路線有3條經(jīng)過中國[18]，隨著中國與世界其他各國之間人員往來的頻繁，WNV在濟(jì)寧甚至中國北方地區(qū)流行的可能性是存在的。在地表水匱乏的旱季，傳播媒介78%可能來自地下棲息地[19]，因此，騷擾庫蚊是研究WNV等蟲媒病毒的良好媒介[20]。

騷擾庫蚊對殺蟲劑的抗性情況在國內(nèi)報道很少，姬淑紅等[21]研究了上海地區(qū)騷擾庫蚊對多種殺蟲劑的抗性水平，結(jié)果顯示騷擾庫蚊對溴氰菊酯抗性倍數(shù)為192.59，與本次測試結(jié)果的抗性水平相當(dāng)。1980年以來，由于農(nóng)業(yè)害蟲危害嚴(yán)重，擬除蟲菊酯類殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治。其他殺蟲劑如氨基甲酸酯和有機(jī)磷，自1990年以來也在該地被使用。騷擾庫蚊一般生長在地下水系中，其與殺蟲劑接觸的機(jī)會可能因棲息環(huán)境類型而與淡色庫蚊不同。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2015年濟(jì)寧城區(qū)淡色庫蚊抗藥性[22]相比，擬除蟲菊酯類抗性水平下降，但殘殺威和DDVP的抗性水平有所上升。與同期淡色庫蚊抗性相比，騷擾庫蚊殘殺威和DDVP的抗性水平也較高，但溴氰菊酯和氯氰菊酯抗性水平相當(dāng)[23]。殺蟲劑的使用在蚊蟲綜合治理和蚊媒疾病控制中做出了巨大貢獻(xiàn)，化學(xué)殺蟲劑使用方便，殺滅效果快，作用強(qiáng)且持久，但易產(chǎn)生環(huán)境污染和使蚊蟲產(chǎn)生抗藥性問題。Bti作為生物殺蟲劑，因其對環(huán)境友好，不易使蚊蟲產(chǎn)生交互抗性和對蚊幼殺滅作用顯著從而使用頻率和范圍逐漸增大。本次研究結(jié)果顯示，騷擾庫蚊對Bti為敏感水平，在未來控制騷擾庫蚊孳生地時可以優(yōu)先使用該種殺蟲劑以達(dá)到較好的滅蚊幼效果。

城市化發(fā)展的過程中，蚊蟲的分布、種類和密度也將發(fā)生變化。騷擾庫蚊與城市環(huán)境密切相關(guān)，隨著該物種在越來越多的地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，我們有必要對該物種的生物學(xué)特點(diǎn)和抗藥性水平進(jìn)行深入了解，特別是作為蚊媒疾病載體的研究有助于評估該種蚊蟲潛在的流行病學(xué)意義。對于騷擾庫蚊在內(nèi)的尖音庫蚊復(fù)合組的吸血習(xí)性的研究，可以揭示引起吸血性和非吸血性蚊蟲的關(guān)鍵差異點(diǎn)，為研發(fā)新型高效殺蟲劑提供理論依據(jù)。針對于目前的情況我們提出以下幾點(diǎn)建議： 1)騷擾庫蚊防治以綜合治理為主，針對于該蚊易棲息的封閉或半封閉場所加強(qiáng)環(huán)境整治，減少孳生地。2)加強(qiáng)蚊媒監(jiān)測，根據(jù)當(dāng)?shù)匚妹郊膊“l(fā)生和流行的特點(diǎn)，分析可能傳播的蚊媒疾病并有針對性地控制蚊蟲密度，從而制定科學(xué)、合理、有效的防治措施。3)孳生地通過采用生物殺蟲劑或生物防治的方法可以減緩蚊蟲抗藥性的發(fā)展。

利益沖突：無