Lnc RNA-PVT1對膿毒癥急性肺損傷巨噬細胞凋亡的影響*

詹方勇 楊 帥 張振林

1.珠海市人民醫(yī)院急診醫(yī)學部，廣東 珠海 519000；2.珠海市人民醫(yī)院EICU，廣東 珠海 519000；3.珠海市人民醫(yī)院檢驗科，廣東 珠海 519000；

急性肺損傷( ALI)是指在感染、燒傷、創(chuàng)傷及放化療等多種致病因素(非心源性)作用下造成的進行性呼吸功能降低與彌漫性肺間質(zhì)，甚至可造成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[1]。ALI的主要特征為肺泡上皮細胞及肺間質(zhì)、肺泡彌漫性水腫與微血管內(nèi)皮細胞損傷，而導致的急性低氧性呼吸功能不全，屬于膿毒癥等嚴重疾病常見的遲發(fā)型并發(fā)癥。ALI發(fā)病率為6. 8%左右，病死率高達40%～50%，嚴重威脅患者生命安全[2]。而誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODs)與膿毒性休克的重要因素為膿毒癥(sepsis)，其中膿毒癥最易受損傷的靶器官為肺臟，最早出現(xiàn)的是ALI與ARDS，且具有最高發(fā)病率，與膿毒癥相關的ARDS 60天致死率高達38.2%[3]。本研究就此以分析Lnc RNA-PVT1對膿毒癥急性肺損傷巨噬細胞凋亡的影響，如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 在上海生科院細胞資源中心取得THP-1單核細胞并進行培養(yǎng)及誘導，使其分化成巨噬細胞，并將THP-1源巨噬細胞分為空白組(TPH-1源巨噬細胞組)、模型組(膿毒癥急性肺損傷巨噬細胞模型)及PVT1-siRNA 組?？瞻捉M給予正常培養(yǎng)液以培養(yǎng)24 h；模型組給以含1 μg·ml-1LPS 培養(yǎng)液易培養(yǎng)24 h；PVT1-siRNA 組在1 μg·ml-1LPS 刺激24 h基礎上，采用Lip-fectamine TM2000 轉染試劑盒轉染siPVT1，在48 h后搜集細胞，并提取總RNA。

1.2方法 ①細胞培養(yǎng)與轉染及分組實驗：使THP-1單核細胞懸浮生長于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% FBS)中，放在培養(yǎng)箱(37 ℃， 5% CO2)中進行培養(yǎng)。生長期細胞取對數(shù)，細胞濃度調(diào)整為1×106cell·ml-1，在96 孔板進行接種，每孔100 μl加入PMA 10 ng，以使THP-1細胞得到誘導從而分化成巨噬細胞( 37 ℃，5% CO2) 。在24 h后，把培養(yǎng)液棄去，漂洗3次RPMI-1640 培養(yǎng)基(以37 ℃溫浴進行漂洗)，并清除未貼壁的THP-1 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h(放在無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基中)。本此實驗使THP-1源巨噬細胞分為空白組、模型組和PVT1-siRNA 組。空白組予以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；模型組予以含1 μg·ml -1 LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；PVT1-siRNA 組在1 μg·ml-1LPS 刺激24 h的基礎上，運用Lip-fectamine TM2000 轉染試劑盒轉染siPVT1，并于48 h后搜集細胞，提取總RNA。②qRT-PCR：提取細胞總RNA(采取RNAiso Plus試劑)。按照逆轉錄試劑盒說明書使提取的總RNA逆轉錄成cDNA。并根據(jù)SYBR Premix TaqⅡ試劑盒進行配置 20 μl 反應體系：SYBRII 10 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl、cDNA 2 μl及無酶水7.6μl。在LightCy-clerTM 480 Ⅱ qPCR(Roche，USA)儀對實時熒光定量PCR進行擴增。反應條件為：95℃預變性30 s之后 95℃ 為5 s，60℃為30 s，以40個循環(huán)進行復性；最后94℃為 90 s，60℃ 為180 s 并延伸，進行擴增曲線繪制。以GAPDH當做內(nèi)參基因，由 2-△△Ct 計算相對定量。本次試驗共計進行4次，結果取平均值對比。

1.3觀察項目 ①對比各組在LPS誘導下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表達情況。②分析IL-1βmRNA、TNF-αmRNA與Lnc RNA-PVT1的表達關系。

2 結 果

2.1對比三組在LPS誘導下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表達情況 PVT1-siRNA組的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表達水平最高，其次是模型組，且三組之間均存在差異，P<0.05。見表1。

表1 各組在LPS誘導下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表達情況比較

注：*表示與空白組對比P<0.05，#表示與模型組對比P<0.05。

2.2分析IL-1βmRNA、TNF-αmRNA與Lnc RNA-PVT1的表達關系 IL-1βmRNA與TNF-αmRNA均于RNA-PVT1呈正相關，P<0.05。見表2。

表2 IL-1βmRNA、TNF-αmRNA與Lnc RNA-PVT1的表達關系分析(n=4)

3 討 論

ALI大多由膿毒癥與敗血癥等多種因素引發(fā)，是炎癥自我氧化與放大而造成機體損傷的一個結果[4]。而由膿毒癥所導致的ALI，其發(fā)病機制最主要的是機體全身發(fā)生瀑布式炎癥反應。在膿毒癥出現(xiàn)時，由于機體會產(chǎn)生大量氧化脂質(zhì)代謝物與炎癥介質(zhì)，導致白細胞與中性粒細胞等炎癥細胞向肺組織浸潤聚集，從而產(chǎn)生大量的炎性因子、氧自由基及趨化因子，最終造成肺組織損傷[5]。

有研究稱[6]，在ALI中l(wèi)ncRNA具有重要作用，其與炎癥反應存在緊密關聯(lián)。這是由于LncRNA屬于長度大于200 nt的非編碼RNA類型之一，且多種疾病均與lncRNA的異常表達相關，如炎癥、腫瘤及心血管疾病等，且lncRNA作為調(diào)節(jié)因子可通過多種途徑參與細胞分化、增殖、凋亡、上皮間質(zhì)轉化及藥物抵抗等[7]。本研究發(fā)現(xiàn)：PVT1-siRNA組的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表達水平最高，其次是模型組，且三組之間均存在差異，P<0.05。提示Lnc RNA-PVT1具有調(diào)控DNA水平、轉錄水平、轉錄后水平及染色體水平作用，且可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的互相作用與RNA及DNA堿基配對以進行調(diào)控機體免疫應答，從而影響炎癥介質(zhì)分泌及免疫細胞的分化與遷移，另外lncRNA PVT1還可通過結合TNF-α 與抑制JNK/NF-kβ信號通路以促進炎癥反應[8]。本研究亦顯示IL-1βmRNA與TNF-αmRNA均于RNA-PVT1呈正相關，P<0.05，提示lncRNA-PVT1在膿毒癥急性肺損傷炎癥反應中可能具有至關重要的作用。

綜上所述，Lnc RNA-PVT1對膿毒癥急性肺損傷巨噬細胞的凋亡具有重要影響作用。