調(diào)心通督針刺法對血管性癡呆大鼠海馬內(nèi)Ang-1表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

朱鈺 廖家鑫 王潤鵬 譚濤

【摘要】 目的：觀察調(diào)心通督針刺法對血管性癡呆（VD）模型大鼠海馬組織內(nèi)Ang-1表達(dá)水平的影響，探討調(diào)心通督針刺法對治療VD模型大鼠可能的機(jī)制。方法：將24只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、藥物對照組、調(diào)心通督組，每組6只。對除假手術(shù)組外的其他三組大鼠采用2-VO法進(jìn)行VD模型制備。造模成功2周后，藥物對照組行尼莫地平灌胃干預(yù)治療、調(diào)心通督組行調(diào)心通督針刺法干預(yù)治療。采用Morris水迷宮試驗(yàn)測試大鼠認(rèn)知及學(xué)習(xí)能力;采用Western-blot法對各組大鼠腦海馬組織中Ang-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果：與模型組比較，藥物對照組和調(diào)心通督組的逃避潛伏期均縮短、跨越次數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;藥物對照組和調(diào)心通督組Ang-1/β-actin值均高于模型組（P<0.05）;但藥物對照組和調(diào)心通督組逃避潛伏期、跨越次數(shù)、Ang-1/β-actin值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：調(diào)心通督針刺法在一定程度上能改善VD大鼠學(xué)習(xí)行為能力，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)大鼠海馬組織中Ang-1表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 調(diào)心通督針刺法 血管性癡呆 血管新生 血管生成素-1

Experiment Study on the Effect of Tiaoxin Tongdu Acupuncture on Ang-1 Expression in Hippocampus of Vascular Dementia Rats/ZHU Yu， LIAO Jiaxin， WANG Runpeng， TAN Tao. //Medical Innovation of China， 2020， 17（03）： 0-024

[Abstract] Objective： To observe the effect of Tiaoxin Tongdu acupuncture on the expression of Ang-1

in the hippocampus of vascular dementia （VD） rats， and to explore the possible mechanism of Tiaoxin Tongdu acupuncture on VD rats. Method： Twenty four SD rats were randomly divided into four groups： sham operation group， model group， drug control group， Tiaoxin Tongdu group， 6 rats in each group. In addition to the sham operation group， the other three groups of rats were used 2-VO method to prepare VD model. Two weeks after the successful establishment of the model， the drug control group was given Nimodipine by gavage， Tiaoxin Tongdu group was given Tiaoxin Tongdu acupuncture. Morris water maze test was used to test the cognitive and learning ability of rats， and Western-blot method was used to detect the expression level of Ang-1 in the hippocampus of rats in each group. Result： Compared with the model group， the escape latency were shortened and stride across times were increased in the drug control group and the Tiaoxin Tongdu group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The value of Ang-1/β-actin in drug control group and Tiaoxin Tongdu group were higher than those in model group （P<0.05）. However， the escape latency， stride across times and Ang-1/β-actin values of the drug control group and Tiaoxin Tongdu group were compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： To some extent， Tiaoxin Tongdu acupuncture can improve the learning behavior of VD rats， and its mechanism may be related to the promotion of Ang-1 expression in the hippocampus of rats.

[Key words] Tiaoxin Tongdu acupuncture Vascular dementia Angiogenesis Angiopoietin-1

First-authors address： Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.03.006

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指因腦血管類疾病引起腦功能的障礙，從而產(chǎn)生一系列智能損害的綜合征，臨床表現(xiàn)多為持續(xù)性和獲得性的高級認(rèn)知功能損傷[1]。近年來，隨著人口老齡化的加劇，我國的VD患病率為0.12%～0.35%，年病死率為10.27%～25.7%，且患病后死亡風(fēng)險(xiǎn)會增加0.63～2.59倍[2]。目前臨床上對VD尚無明確的診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)[3]，常用的治療方法包括增加腦細(xì)胞代謝、促進(jìn)腦血液循環(huán)、減輕腦組織炎癥反應(yīng)等對癥治療[4]，暫無特效的治療方法。調(diào)心通督針刺法以手厥陰心包經(jīng)諸穴配合督脈穴位振發(fā)體內(nèi)陽氣、溫煦臟腑腦髓，以達(dá)到調(diào)理臟腑、通絡(luò)開竅、標(biāo)本兼治的目的。本課題組在前期臨床實(shí)驗(yàn)中證實(shí)調(diào)心通督針刺法可有效提高VD患者M(jìn)MSE智力評分，顯著改善患者臨床癥狀[5]，但其機(jī)制尚不明確。促血管生成素（angiopoietin，Ang）是繼血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）之后，近年來發(fā)現(xiàn)的第二類血管生成因子家族，它由血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞所分泌[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1與其受體結(jié)合后，可促進(jìn)缺血區(qū)新生血管數(shù)量的增加和側(cè)支循環(huán)的建立，并且減少了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而有利于神經(jīng)元傳導(dǎo)及傳遞信息功能的恢復(fù)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察調(diào)心通督針刺法對VD模型大鼠海馬中Ang-1表達(dá)水平的影響，來探討調(diào)心通督針刺法的作用機(jī)制，為臨床治療提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組 健康SPF級SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量（230±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及觀察在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行（SPF級），控制溫度20～25 ℃，濕度50%～60%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、藥物對照組、調(diào)心通督組，每組6只。

1.2 試劑和儀器 10%水合氯醛（長沙維爾生物科技有限公司）、尼莫地平片（生產(chǎn)廠家：鄭州瑞康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H41022175）、氨芐西林膠囊（生產(chǎn)廠家：哈藥集團(tuán)制藥總廠，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H23022658）、Anti-VEGF（19003-1-AP，美國proteintech公司）、Anti-ST2（23302-1-AP，美國proteintech公司）、β-actin antibody（60008-1-Ig，美國proteintech公司）、HRP goat anti-mouse IgG（SA00001-1，美國proteintech公司）、HRP goat anti-rabbit IgG（SA00001-2，美國proteintech公司）、安迪牌一次性針灸針0.25 mm×25 mm（貴州安迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）、Mirros水迷宮（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供）、眼科手術(shù)剪（長沙維爾生物科技有限公司）、眼科用手術(shù)鑷（長沙維爾生物科技有限公司）。

1.3 模型制備與評價(jià) 采用兩血管阻斷法（2-VO）制備VD模型[9]：將大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，后仰臥位固定在手術(shù)臺上，頸部剪毛備皮，碘伏消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈（CCA），用4號縫合線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈遠(yuǎn)心端與近心端，從中剪斷血管，術(shù)后在創(chuàng)口處撒適量青霉素粉末，縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎及剪斷。模型評價(jià)：造模2周后，分別對每只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試，以造模前假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期均值作為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算造模后每只大鼠逃避潛伏期均值和參考值之差與參考值的比值，>20%即為大鼠VD模型[10]。

1.4 干預(yù)措施 （1）調(diào)心通督組：VD模型復(fù)制成功后，參照華興邦動物穴位圖譜及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11-12]，取“百會”“神庭”“大椎”“水溝”“風(fēng)府”“命門”行斜刺，“內(nèi)關(guān)”“大陵”“勞宮”行直刺，捆綁后針刺，穿透大鼠皮膚1～2 mm，進(jìn)針后行小幅度捻轉(zhuǎn)，予平補(bǔ)平瀉手法，每10分鐘行針1次，共留針30 min，1次/d，連續(xù)治療2周。（2）藥物對照組：該組大鼠給予尼莫地平0.062 5 g/kg與蒸餾水混合后制成混懸液，按10 mL/kg體重灌胃，灌胃后與調(diào)心通督組同時(shí)捆綁，1次/d，連續(xù)2周。（3）模型組與假手術(shù)組同調(diào)心通督組捆綁，不針刺，不給藥，療程同調(diào)心通督組。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測 治療結(jié)束后再次進(jìn)行Morris水迷宮檢測。在圓形水池內(nèi)加入清水，水池直徑160 cm，高40 cm，水深30 cm。將池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，任選一象限正中放置無色透明圓形平臺，使平臺沒入水下2 cm。檢測包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，第2天開始連續(xù)測試4 d，每天4次，每次將大鼠分別從不同的4個(gè)象限放入水中，記錄其120 s內(nèi)尋找到平臺的時(shí)間，即為逃避潛伏期。如果120 s之內(nèi)未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)員幫助引導(dǎo)其上平臺，并停留10 s，記錄逃避潛伏期為120 s。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：第4天測試結(jié)束后，撤除平臺，于平臺所在位置對側(cè)象限將大鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠游過原平臺所在位置的次數(shù)。

1.5.2 海馬Ang-1測定 將大鼠用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉后斷頭取腦，置于冰盤上，迅速分離出海馬組織，按照重量和體積1︰10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，12 000 r/min離心10 min后，收集上清液，采用Western-blot測定，操作遵照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Mirrors水迷宮檢測結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期延長、跨越次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，藥物對照組和調(diào)心通督組的逃避潛伏期均縮短、跨越次數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但藥物對照組和調(diào)心通督組逃避潛伏期、跨越次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠海馬Ang-1表達(dá)水平比較 Western-blot檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、藥物對照組、調(diào)心通督組Ang-1/β-actin值分別為（0.290±0.057）、（0.365±0.031）、（0.617±0.044）、（0.560±0.053）。模型組、藥物對照組、調(diào)心通督組Ang-1/β-actin值均高于假手術(shù)組（P<0.05）;藥物對照組和調(diào)心通督組Ang-1/β-actin值均高于模型組（P<0.05），但藥物對照組和調(diào)心通督組Ang-1/β-actin值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)中，癡呆根據(jù)其臨床癥狀歸屬于“癲證”“呆癡”“善忘”的范疇，其病位在腦，病機(jī)一般為腦髓消減、痰瘀痹阻、神機(jī)失用。調(diào)心通督針刺法是全國名老中醫(yī)嚴(yán)潔教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合科研實(shí)踐所創(chuàng)立的一種針刺方法。調(diào)心通督針刺法認(rèn)為腦主神明是腦生理功能的基本部分，是思慮、記憶、司主肢竅的重要前提，而心為“君主之官”“五臟六腑之大主”，充分說明了心和神明的密切聯(lián)系，故神志類疾病均可從心論治。然而心包作為心的屏障，可代心受邪，故本法選取手厥陰心包經(jīng)作為治療途徑之一。腦竅和神志的清明與督脈功能密切相關(guān)，故有“病變在腦，首取督脈”之說[13]，督脈總督人體一身之陽，其循行“上額交巔，入絡(luò)腦”，且督脈源于胞中，與腦、髓、腎精關(guān)系密切，精生髓，髓充腦，腦寧則神安。故將心包經(jīng)與督脈相配，共奏調(diào)理臟腑、安神定志之效。

VD患者臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退，此類表現(xiàn)的主要腦功能區(qū)在海馬。海馬區(qū)是人類學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，同時(shí)也是對腦缺血的敏感區(qū)域[14]，短暫性腦缺血即可造成海馬區(qū)神經(jīng)元不可逆性結(jié)構(gòu)損傷。所以，在腦缺血后建立側(cè)支循環(huán)以增加缺血區(qū)血流量，改善缺血區(qū)周圍的血氧含量，從而減輕缺血損傷是十分重要的。血管新生是由多種促血管生成因子和抑制血管生成因子相互作用的結(jié)果。Ang是一族特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，也是最重要的血管穩(wěn)定因子，其對腦缺血后的血管新生有正性調(diào)控的作用[15]。Ang-1具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的能力，并且能夠特異性的激活受體Tie2，使其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，以此促進(jìn)血管的新生[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1具有促進(jìn)血管生成、穩(wěn)定血管的作用，在腦缺血后，可通過多重作用機(jī)制，改善腦血流灌注，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元，以此改善腦缺血后神經(jīng)功能的預(yù)后[18-19]。除此之外，Ang-1還具有減輕血管炎癥反應(yīng)、減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等作用[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察各組大鼠海馬組織中Ang-1的表達(dá)變化以及行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，藥物對照組和調(diào)心通督組的逃避潛伏期均縮短、跨越次數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，藥物對照組和調(diào)心通督組Ang-1表達(dá)水平均上調(diào)（P<0.05）;但藥物對照組和調(diào)心通督組逃避潛伏期、跨越次數(shù)、Ang-1/β-actin值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由于大鼠的腦組織損傷會促進(jìn)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生Ang-1的表達(dá)釋放，故模型組中Ang-1高于假手術(shù)，針刺治療及藥物治療均可促進(jìn)Ang-1的表達(dá)，故干預(yù)方法有效。且上述結(jié)果說明藥物及調(diào)心通督針刺法均能改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且均可通過上調(diào)Ang-1水平改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這與筆者在臨床的研究發(fā)現(xiàn)一致。

綜上所述，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示采用調(diào)心通督針刺法控制甚至逆轉(zhuǎn)VD患者認(rèn)知功能障礙是可行的，進(jìn)一步揭示調(diào)心通督針刺法治療VD的機(jī)制可能與調(diào)控腦海馬組織中Ang-1蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腦缺血區(qū)血管新生有關(guān)，由此為臨床應(yīng)用和推廣調(diào)心通督針刺法治療VD提供了可靠的動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-11-15） （本文編輯：董悅）