銅脅迫下兩種生態(tài)型杠板歸形態(tài)生理的差異性

吳 曼，龔 云，彭 穎，張文玉，鄒 添，陳 亮

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002; 2.湖北大別山國家級自然保護(hù)區(qū)英山管理局，湖北 黃岡 438700)

0 前言

銅是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素, 在細(xì)胞中，銅元素的存在形式為Cu+和 Cu2+，在植物的生長發(fā)育過程中行使重要功能，以含銅蛋白的形式參與各種新陳代謝過程，如光合作用、呼吸作用電子傳遞鏈、活性氧代謝、對乙烯的感受、氮代謝、細(xì)胞壁的木質(zhì)化及花粉的形成等[1]。植物在根毛部位協(xié)同水分代謝活動，能夠通過單向運(yùn)輸載體蛋白順著濃度梯度單向運(yùn)輸或主動運(yùn)輸把銅運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。通過共質(zhì)體、質(zhì)外體途徑運(yùn)輸?shù)礁膬?nèi)部，再由蒸騰拉力和根壓運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€部位，以酶的方式參與植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，并影響植物的呼吸作用。但是當(dāng)環(huán)境條件中銅的含量超過其最大承受時，植物就會受到脅迫，進(jìn)而對植物造成影響。

黃石大冶銅錄山銅礦遺址土壤中累積大量的重金屬銅礦廢棄物，造成嚴(yán)重的土壤重金屬污染[2～3]，但杠板歸的生長卻十分繁茂。杠板歸(PolygonumperfoliatumL)，是一種一年生攀援草本植物，蔓生在野路旁。由于其中藥功效，又名河白草、蛇倒退、梨頭刺、蛇不過等。束文圣等人對該礦區(qū)杠板歸等5種優(yōu)勢物種對重金屬的吸收積累和遷移特性進(jìn)行測定和比較，發(fā)現(xiàn)它們對Cu表現(xiàn)出了很高耐性[2]。且許多研究表明，杠板歸對錳等重金屬具有較強(qiáng)的富集作用，可以用于錳等重金屬污染的治理修復(fù)[4]。但劉小紅等人發(fā)現(xiàn)雖然杠板歸以及鴨趾草對長江沿線銅礦區(qū)Cu有較多的吸收[5]，卻不足以達(dá)到富集量與生物量比值大于1000 mg·kg-1的超富集水平[6]。盡管目前有關(guān)杠板歸的研究工作已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但是大部分研究主要集中在將杠板歸作為中藥材論述其應(yīng)用以及栽培技術(shù)等方面，在對銅的抗脅迫作用的研究卻鮮見報道。我們在銅錄山銅礦區(qū)和生活區(qū)(湖北師范大學(xué)區(qū)劃范圍內(nèi))都發(fā)現(xiàn)杠板歸的分布，但在礦區(qū)的耐受型和生活區(qū)的敏感型杠板歸植株顏色和葉子形狀都有明顯差異。由此我們實驗室采集礦區(qū)耐受型杠板歸和對照組敏感型杠板歸，通過對比銅離子對兩種生態(tài)型杠板歸形態(tài)和光合作用兩方面生理特征的影響，希望可以初步探究杠板歸抗銅離子脅迫的生理機(jī)理，并為礦區(qū)對銅等重金屬的生物治理提供理論支撐和指導(dǎo)。

1 實驗方法

1.1 杠板歸樣本采集與培養(yǎng)

采集來自大冶市銅錄山和湖北師范大學(xué)校園內(nèi)的杠板歸，采樣時盡量選取生長良好的幼嫩枝條，從頂端往下剪取10～15cm枝條。將采集到的杠板歸進(jìn)行水培，用CuSO4·5H2O以1/2Hoagland營養(yǎng)液作為基礎(chǔ)液配成不同濃度梯度的含銅離子的培養(yǎng)液，分別為0 μg/mL,100 μg/mL,200 μg/mL,300 μg/mL,400 μg/mL 5個濃度梯度，每個梯度每種類型2個重復(fù)，置于正常光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每隔3天換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約7天。

1.2 形態(tài)特征的測定

每組選取3～5株材料長勢一致、生長狀態(tài)良好的杠板歸進(jìn)行根長、株高等形態(tài)指標(biāo)測定。測量根長(即第一個根毛基處至最末端的根尖之間的長度)和莖長(即由第一個根毛基處至莖頂端的長度)。

1.3 葉綠素含量的測定

從每個濃度銅離子處理的杠板歸中選取葉片0.5 g，剪成碎塊，每組設(shè)置3個重復(fù)，利用丙酮提取法浸提，以80%丙酮為對照，分別測定663 nm、645 nm處的吸光值[7]。根據(jù)Lamber-beer定律，利用公式：

Ca=12.7OD663-2.69OD645Cb=22.9OD645-4.68OD663

CT=Ca+Cb

求出紅、綠桿馬齒莧中葉綠素a、b的含量。

1.4 光合指標(biāo)的測定

從每個濃度銅處理的杠板歸選取6片大且無損傷的葉片利用 TPS-2光合儀進(jìn)行葉片蒸騰速率(E)，氣孔導(dǎo)度(G)，凈光合速率(A)，細(xì)胞間CO2的濃度(CI)的測量。

2 實驗結(jié)果

2.1 形態(tài)特征比較

2.1.1 兩種杠板歸根莖葉形態(tài)差異

通過形態(tài)上觀察，我們發(fā)現(xiàn)耐受型(銅錄山組)根系較為發(fā)達(dá)，基部粗壯，莖干直徑較大；敏感型(校園本地)根部較弱，且莖干直徑較小植株多呈現(xiàn)倒伏狀。如圖1所示。

A B

2.1.2 莖長和根長的增長情況

由圖2分析得，兩種生態(tài)型的杠板歸的根與莖的增長率分別呈先上升后下降的趨勢，且耐受型的根和莖的增長率一直高于敏感型的杠板歸。同時，敏感型的根與莖在100 mg/L銅離子濃度時有最大增長率，耐受型的根與莖在150 mg/L的銅離子濃度時有最大增長率，且耐受型杠板歸植株的莖稈和根系增長率呈現(xiàn)較大的區(qū)別。

圖2 不同Cu2+濃度下兩種生態(tài)型杠板歸的根和莖的增長率，不同字母表示在0.05水平的顯著差異

2.2 光合指標(biāo)比較

由圖3可知，在經(jīng)過不同銅濃度處理兩周后，敏感型杠板歸的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均隨著銅離子的濃度增高呈減小的趨勢，且銅離子濃度為200 mg/L時，其數(shù)值最??；而耐受型杠板歸的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均隨著銅離子濃度的增高呈增大的趨勢，且銅濃度為150 mg/L時，其數(shù)值最大(A、C圖)。

Cu2+Concentration(mg/L)

圖3 不同銅離子濃度處理下兩種生態(tài)型杠板歸氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率、光合速率指標(biāo)

Cu2+Concentration(mg/L)

圖4 不同銅離子濃度下杠板歸葉綠素總含量

耐受型和敏感型杠板歸的細(xì)胞間二氧化碳濃度、光合速率均隨著銅濃度的增加而降低，且耐受型杠板歸在銅離子濃度為200mg/L時，光合速率最低為1.88；在銅離子濃度為100 mg/L時最高達(dá)到4.00；敏感型杠板歸在銅離子濃度為200 mg/L時，光合速率最低為0.90；在銅離子濃度為150 mg/L時最高達(dá)到2.10 .但耐受型杠板歸胞間二氧化碳濃度、光合速率始終在敏感型杠板歸之上(B、D圖)。

2.3 葉綠素含量比較

由圖4 A可知，耐受型杠板歸的葉綠素b的含量要高于葉綠素a的含量，葉綠素b的含量在銅離子濃度為200 mg/L時達(dá)到最大，葉綠素a的含量在銅離子濃度為150 mg/L時達(dá)到最大；由圖4 B可知，敏感型杠板歸的葉綠素a的含量首先高于葉綠素b的含量，在銅離子濃度為150 mg/L后，葉綠素b的含量要高于葉綠素a的含量，葉綠素b的含量在銅離子濃度為150 mg/L時達(dá)到最大，葉綠素a銅離子濃度為150 mg/L時達(dá)到最大。

3 討論分析

植物常常通過在形態(tài)和生理等方面采取不同的響應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對不良環(huán)境。目前，國內(nèi)外學(xué)者研究了多種植物在銅污染條件下的生長，結(jié)果表明，低濃度的銅離子能夠促進(jìn)植物種子萌發(fā)和生長，但當(dāng)銅離子濃度繼續(xù)增加后，對植物生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用[8～9]，甚至死亡[10]。如張剛等人[11]研究發(fā)現(xiàn)適量的銅對黑麥草生長起到促進(jìn)作用，但是超出了閾值的銅對生長有抑制，會使其生長緩慢，根停止生長，最終枯死；植株矮化，葉黃化，這與我們的實驗結(jié)果一致(圖1)，驗證了我們的結(jié)論。另外，由根和莖的增長率可以看出(圖2)，杠板歸在適應(yīng)不同的環(huán)境時，會產(chǎn)生不同的響應(yīng)機(jī)制，在營養(yǎng)分配上的表現(xiàn)較為突出。在離子脅迫下，刺激根系生長，改變生長中心，調(diào)控生長優(yōu)勢部位，減低地上蒸騰部位比例，以適應(yīng)環(huán)境變化。而在我們實驗中耐受型較之于敏感型發(fā)達(dá)的根系以及更強(qiáng)的根莖增長率也進(jìn)一步驗證了這個論斷。

光合作用是植物生命活動的基礎(chǔ)，是產(chǎn)生能量的重要來源，因此環(huán)境脅迫下植物光合作用的強(qiáng)弱也是反映植物生長狀況重要生理指標(biāo)。王鈞[12]等人研究表明與對照組相比，在低濃度處理時耐受型杠板歸的氣孔導(dǎo)度、光合速率均上升，胞間二氧化碳濃度下降，高濃度處理后兩種杠板歸的氣孔導(dǎo)度、光合速率均下降，胞間二氧化碳濃度上升。本實驗中，隨著銅離子濃度的升高，耐受型杠板歸的各項指標(biāo)始終位于敏感型之上，通過文獻(xiàn)調(diào)研我們知道高等植物進(jìn)行光合作用第一重要生產(chǎn)的物質(zhì)是葉綠素，它含量的高低是影響光合作用強(qiáng)弱的重要因素，因此葉綠素動態(tài)變化可以反映植物受環(huán)境脅迫后的生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫處理下，活性氧在細(xì)胞中增加，其更多地擴(kuò)散到葉綠體內(nèi)，從而加速了葉綠素的降解[13]；同時，由于Cu2+局部積累過多，與葉綠體中蛋白質(zhì)-SH 結(jié)合或取代其中的Fe2+、Zn2+、Mg2+，致使葉綠素蛋白中心離子組成發(fā)生變化而失活[14],且葉綠素a不及葉綠素b穩(wěn)定，所以葉綠素a的降幅大于葉綠素b 。本試驗結(jié)果表明，不同濃度Cu2+處理下，敏感型杠板歸葉片葉綠素總量、葉綠素a、b含量明顯變化，且葉綠素a / b下降；耐受型杠板歸葉片葉綠素總量、葉綠素a、b含量變化較為平緩，且葉綠素a / b比值增大，由此說明在同等脅迫條件下銅錄山(耐受型)杠板歸光合作用相對于敏感型更強(qiáng)，因而植株更為健壯從而增強(qiáng)對脅迫的耐受型。

當(dāng)然除開外觀形態(tài)、光合生理指標(biāo)方面，耐受型和敏感型植株都表現(xiàn)出明顯差異，且通過我們實驗也證實在較高濃度銅脅迫條件下植株生長更為良好，但是這兩種不同生態(tài)型杠板歸在銅脅迫下，其他生理指標(biāo)中存在哪些差異仍需進(jìn)一步探究。