大豆乳清水一級浮渣粉中大豆異黃酮的提取工藝研究

劉 軍，魯緒強(qiáng)，時(shí)玉強(qiáng)，李 敏，尹成文，劉代成

(1.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 禹城 251200； 2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

大豆異黃酮有抗癌、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、抗老年性癡呆、抗機(jī)體免疫力下降、抗菌消炎、抗衰老等生理功能，是天然的植物保健品[1-4]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001年全球的大豆異黃酮需求量是1 500 t，而每年的實(shí)有產(chǎn)量只有500 t[5]。2001年至今，雖然未見全球大豆異黃酮需求量市場預(yù)測的報(bào)道，但從國內(nèi)外大豆異黃酮的研究來看，科學(xué)研究越來越深入，應(yīng)用面不斷擴(kuò)展，其需求量逐年增加，供需差距會(huì)越來越大。大豆異黃酮的提取原料主要為脫脂豆粕[4，6-8]、大豆胚[9]、大豆[1,10]和豆芽[10]，生產(chǎn)上以脫脂豆粕為主，可用于生產(chǎn)大豆異黃酮的其他資源極少，是導(dǎo)致大豆異黃酮產(chǎn)量少、供需矛盾突出的重要原因。

大豆分離蛋白的生產(chǎn)以低溫脫脂豆粕為原料，低溫脫脂豆粕經(jīng)堿溶酸沉分離出蛋白的同時(shí)，排出大豆乳清水。大豆乳清水中經(jīng)3次添加聚合氯化鋁和聚丙烯酰胺絮凝后，鼓氣成一、二、三級泡沫，再經(jīng)捕沫、破泡和板框過濾得浮渣，其中一級浮渣富含大豆異黃酮。由于一級浮渣中所含聚丙烯酰胺和聚合氯化鋁有一定毒性，只能作為廢物燃燒。將大豆乳清水一級浮渣中含有的大豆異黃酮提取純化成大豆異黃酮產(chǎn)品，不僅可解決大豆異黃酮原料短缺問題，還可變廢為寶獲得良好經(jīng)濟(jì)效益。

大豆乳清水一級浮渣是制備大豆異黃酮的新原料，至今未有學(xué)者研究。本文致力于建立從大豆乳清水一級浮渣中提取、分離、純化大豆異黃酮的工藝，為大豆乳清水一級浮渣的回收利用提供新方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆乳清水一級浮渣粉(SP)，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸、磷酸鈣、碳酸氫鈣、乙醇，分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元、染料木素，色譜純，北京索萊寶科技有限公司。大孔樹脂ADS-21、AB-8、HPD600、D4020、D4006，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。

HH-S型恒溫水浴鍋； TLC scanner III型薄層掃描儀(WINCATS1.4.4軟件)，瑞士CAMAG公司；JY02G型凝膠成像儀；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA株式會(huì)社；GF254硅膠板(10 cm×20 cm)；JM膠體磨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆異黃酮的提取

將一定量的大豆乳清水一級浮渣粉(SP)用體積分?jǐn)?shù)40%～95%的乙醇(料液比1∶5)在40～100℃膠體磨提取0.75 h，過濾得濾液，重復(fù)提取1次。合并2次濾液，于35～70℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得粉狀物。

1.2.2 大豆異黃酮的分離

將1.2.1提取的粉狀物和一定量的Ca3(PO4)2以及Ca(HCO3)2加入蒸餾瓶中，按料液比1∶20加入95%乙醇，沸騰回流1 h后過濾。上清液于35～70℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得膏狀物。

1.2.3 大豆異黃酮的純化

1.2.3.1 大孔樹脂的選擇

大孔樹脂預(yù)處理：將大孔樹脂ADS-21、HPD600、D4006、D4020、AB-8均置于95%乙醇中浸泡24 h以上(中間攪拌數(shù)次，并更換一次浸泡液)。

樹脂的選擇：取2.0 g濕樹脂，將160 mg 大豆異黃酮超聲溶解于50 mL水中后倒入其中。室溫下振蕩吸附24 h，測其上清液中的大豆異黃酮濃度，計(jì)算樹脂吸附大豆異黃酮的質(zhì)量及吸附率。濾除上清液，去離子水洗滌樹脂，過濾后加入50 mL 95%乙醇，室溫下振蕩解吸24 h，測其解吸液中大豆異黃酮含量，計(jì)算大豆異黃酮的解吸量和解吸率。

1.2.3.2 大孔樹脂純化大豆異黃酮

大孔樹脂按1.2.3.1處理后，取40 g濕大孔樹脂進(jìn)行濕法裝柱(3 cm×30 cm)，不超過柱體積的1/3，保持大孔樹脂一直浸泡于溶液中，防止空氣進(jìn)入其中。2 BV去離子水沖洗乙醇，向柱面加入分離制備的膏狀物3.05 g。用4～8 BV去離子水洗脫膏狀物中水溶性雜質(zhì)后，用2 BV 95%乙醇進(jìn)行洗脫，先流出的淡黃色液體棄掉，保留深黃色洗脫液，再加8～12 BV 95%乙醇直到深黃色帶全部洗脫出。將所得洗脫液在57℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得大豆異黃酮結(jié)晶。

1.2.4 大豆異黃酮含量的測定

樣品液的配制：用乙酸乙酯分別將0.32 g樣品(包括提取物、分離的膏狀物以及純化的結(jié)晶)定容至3 mL，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用甲醇分別將黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元定容為1.58、1.18、1.09、0.32、1.38 mg/mL。用乙酸乙酯將染料木素定容為1.04 mg/mL。

按參考文獻(xiàn)[11]的方法檢測樣品中大豆異黃酮含量，將大豆異黃酮苷元及苷總量作為大豆異黃酮的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮提取條件的選擇

常用的提取大豆異黃酮的溶劑為乙醇、甲醇和丙酮等。從毒性、經(jīng)濟(jì)成本以及生產(chǎn)要求考慮，決定使用乙醇為提取溶劑。現(xiàn)有研究亦大多采用乙醇作為提取溶劑。按1.2.1對SP中大豆異黃酮進(jìn)行提取，探討了提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對大豆異黃酮提取量的影響，結(jié)果見表1。

由表1可見，在料液比1∶5、膠體磨提取時(shí)間0.75 h、提取2次、提取溫度60～70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，大豆異黃酮的提取量最大。按照該提取方法重復(fù)3次，結(jié)果穩(wěn)定。每100 g SP可提取干物質(zhì)20 g，其中含415 mg 大豆異黃酮，大豆異黃酮含量為2.08%(干基)，雜質(zhì)較多。

表1 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對大豆異黃酮提取量的影響

前人以脫脂豆粕、大豆和豆芽為原料提取大豆異黃酮所用乙醇的有效體積分?jǐn)?shù)為50%～80%，料液比為1∶(3～50)，提取溫度為50～80℃，提取次數(shù)為1～3次，提取時(shí)間為1～9 h[1,3-4,6,10,12-16]。 據(jù)長期生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，乙醇的用量大會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本高、投資大，提取次數(shù)多、提取時(shí)間長會(huì)影響生產(chǎn)周期和產(chǎn)量。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，我們認(rèn)為膠體磨可代替攪拌，且效果比攪拌更均勻。本文采用膠體磨提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶5，提取溫度60～70℃，提取時(shí)間0.75 h，提取2次，可以把SP中的大豆異黃酮提取出來。

2.2 大豆異黃酮分離條件的選擇

按1.2.2方法，向20 g SP提取物中加入95%乙醇及一定量的Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2進(jìn)行沸騰回流1 h，濾液濃縮成膏狀物。Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2添加量對大豆異黃酮含量的影響見表2。

表2 Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2添加量對大豆異黃酮含量的影響

由表2可知，20 g SP提取物，加20 g Ca3(PO4)2和8 g Ca(HCO3)2回流去雜效果最好，可得膏狀物3.05 g，大豆異黃酮含量約為13.6%(干基)，大豆異黃酮在去雜過程中基本無損失。

關(guān)于乙醇提取的大豆異黃酮粗提物去雜分離，董文賓等[14]采用酸解法，用0.2 mol/L HCl在料液比1∶6、85℃下酸解2 h，可使大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)為苷元，并沉淀出部分雜質(zhì)。高榮海等[6]對乙醇提取濃縮物采用等電點(diǎn)沉淀除蛋白的方法，用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4～4.5，然后離心沉降除去蛋白質(zhì)。袁建等[17]將大豆異黃酮提取液濃縮后，向濃縮液中加入2 mol/L HCl調(diào)至等電點(diǎn)，經(jīng)離心除去上層漂浮物和下層沉淀，清液調(diào)至中性后超濾除去蛋白。李文亮[12]將乙醇提取液濃縮后采用酸解的方法除雜，用0.1 mol/L HCl，在料液比1∶5、40℃下酸解3 h，分解率為5.25%。牛新春[13]對大豆異黃酮提取液離心后采用超濾方法分離雜質(zhì)，膜截留相對分子質(zhì)量10 kDa，過膜壓力137.9 kPa，過膜溫度40℃，溶液質(zhì)量濃度0.25～0.37 mg/mL，純度比超濾前提高26.1%。胡衛(wèi)新等[15]對大豆異黃酮提取液加0.03 g/mL ZnCl2后，靜置分層，鹽析沉淀蛋白，上清液在4 000 r/min離心15 min，除雜效果較好。上述除雜方法均效果良好。但本文對酸解、調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、離心沉淀等方法預(yù)試驗(yàn)后未獲得良好效果(該試驗(yàn)數(shù)據(jù)未列入本文)，這可能與本文所使用的新原料SP有關(guān)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)明確SP提取物中的雜質(zhì)主要是蛋白、多糖、油脂、脂肪酸等，油脂、蛋白、多糖在乙醇中溶解性低，可被Ca3(PO4)2吸附和沉淀，羧酸類物質(zhì)雖然在乙醇中溶解性高，但可以與Ca(HCO3)2結(jié)合成鈣鹽而沉淀。另外，這兩種添加物能夠保持大豆異黃酮的分子結(jié)構(gòu)。因此，這是一種適合于乙醇提取大豆乳清水一級浮渣粉中大豆異黃酮工藝的分離除雜的新方法。

2.3 大豆異黃酮的純化

2.3.1 大孔樹脂的選擇

大孔樹脂純化大豆異黃酮作為一個(gè)有效方法已被多次研究證實(shí)。高榮海等[6]對乙醇提取的大豆異黃酮粗提物等電點(diǎn)沉淀分離后經(jīng)大孔樹脂HPD600吸附洗脫、濃縮、丙酮精制，大豆異黃酮產(chǎn)品純度為70.56%。袁建等[17]對大豆異黃酮分離液用聚酰胺和大孔樹脂吸附洗脫、精制，產(chǎn)品純度為65.4%。李文亮[12]用S-8大孔樹脂對大豆異黃酮分離液進(jìn)行吸附洗脫，效果良好。牛新春[13]研究了大孔樹脂精制大豆異黃酮方法，比較了AB-8、D-101、ADS-213型大孔樹脂的精制效果，認(rèn)為ADS-21效果最佳。潘廖明等[18]對9種大孔樹脂吸附大豆異黃酮的特性進(jìn)行了詳細(xì)研究，認(rèn)為LSA-8有較好的選擇性和解吸能力，所得產(chǎn)品中大豆異黃酮含量可達(dá)57%，比原樣純度提高了4.8倍。蔡立等[3]研究了7種大孔樹脂對大豆異黃酮的吸附解吸效果，結(jié)果表明D4006和H103型大孔樹脂有較好的吸附解吸效果，3%大豆異黃酮樣品經(jīng)D4006型大孔樹脂吸附洗脫(洗脫劑為80%乙醇)后大豆異黃酮含量提高到30.58%。大豆乳清水一級浮渣粉是制備大豆異黃酮的新原料，其大豆異黃酮的提取分離工藝是一個(gè)新工藝，利用大孔樹脂吸附洗脫該樣品大豆異黃酮有很多不確定因素，因此必須探討所選擇大孔樹脂的吸附洗脫生產(chǎn)參數(shù)。本文按照1.2.3.1方法對ADS-21、AB-8、HPD600、D4020、D4006 5種大孔樹脂進(jìn)行了比較，結(jié)果見表3。

表3 不同類型大孔樹脂的吸附率、吸附量、解吸量及解吸率比較

由表3可知，5種大孔樹脂相比較，ADS-21對大豆異黃酮的吸附率、吸附量、解吸量最高，解吸率較高。所以，選擇ADS-21用于純化大豆異黃酮。

2.3.2 大孔樹脂ADS-21純化大豆異黃酮的結(jié)果

按照1.2.3.2方法，采用ADS-21大孔樹脂純化大豆異黃酮，得到的黃色結(jié)晶質(zhì)量為489.82 mg，大豆異黃酮含量為83.5%，為洗脫前膏狀物的6.14倍。試驗(yàn)結(jié)果良好，為SP制備大豆異黃酮提供了生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本文以大豆乳清水一級浮渣粉(SP)為原料制備大豆異黃酮，選擇60%乙醇作提取溶劑，在料液比1∶5、提取溫度60～70℃下采用膠體磨提取2次，每次0.75 h，每100 g SP可提取干物質(zhì)20 g，其中大豆異黃酮含量為2.08%。該20 g提取物加20 g Ca3(PO4)2、8 g Ca(HCO3)2和400 mL 95%乙醇沸騰回流1 h，過濾濃縮后可得3.05 g膏狀物，大豆異黃酮含量為13.6%，除雜分離效果好。用大孔樹脂ADS-21對膏狀物吸附洗脫，濃縮得大豆異黃酮產(chǎn)品，含量為83.5%，為洗脫前膏狀物的6.14倍。整個(gè)提取、分離、純化工藝完善，所得大豆異黃酮純度較高，為以大豆乳清水一級浮渣粉作原料制備大豆異黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)。