樟樹籽仁油對(duì)高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體脂和血脂水平的影響

李彥宸，林 慧，李奕潼，曾哲靈，余 平，3，文學(xué)方，4

(1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌 330031； 2.南昌大學(xué) 江西省藥食同源植物資源高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330031；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047； 4.江西省科學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)研究所，南昌 330096)

日常飲食中的油脂以含有12個(gè)以上碳原子的長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFAs)構(gòu)成的長(zhǎng)鏈甘油三酯(LCTs)為主。攝入體內(nèi)的LCTs優(yōu)先儲(chǔ)存在脂肪、肝臟等組織中[1]。LCTs會(huì)增加體內(nèi)脂肪積累、肝臟脂肪、血脂和血糖水平。長(zhǎng)期過量攝入LCTs會(huì)導(dǎo)致肥胖，進(jìn)而引發(fā)脂肪肝、高脂血癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等肥胖并發(fā)疾病[2]。

研究表明，含8～10個(gè)碳原子數(shù)的中鏈脂肪酸(MCFAs)即辛酸和癸酸構(gòu)成的中鏈甘油三酯(MCTs)具有特殊的生物活性和生理作用[3]。MCTs在體內(nèi)的水解、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝過程與LCTs不同,MCTs具有減少體內(nèi)脂肪沉積和肝臟脂變、降低血脂和血糖水平等作用[4-5]。牛奶和母乳中含有6%～17%的MCFAs,棕櫚仁油和椰子油含有50%～60%的MCFAs。但天然MCTs資源極少，至今仍以椰子油和棕櫚仁油為原料，通過水解、精餾及酯化工藝生產(chǎn)MCTs產(chǎn)品[3]。

2008年開始出現(xiàn)一些有關(guān)樟樹籽仁油(Cinnamomumcamphoraseed kernel oil，CCSKO)的組成和結(jié)構(gòu)、食用安全性、生化特性和生理作用方面的研究報(bào)道。這些研究結(jié)果表明，CCSKO含MCFAs達(dá)96%以上(其中辛酸 0.3%～2.6%、癸酸51%～62%、月桂酸34%～40%)，具有減少體內(nèi)脂肪沉積和肝臟脂變、降低血脂和血糖作用[6-8]。但有關(guān)飲食中CCSKO含量與CCSKO減少體脂、降低血脂效果之間的關(guān)系至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究飼料中CCSKO含量對(duì)CCSKO降低高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體脂和血脂效果的影響，為CCSKO的高值化開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4周齡的C57BL/6雄性小鼠100只，體重13～16 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 原料與試劑

樟樹籽仁油，由本課題組從樟樹籽仁中提取(熱榨后脫酸、脫色)而得到。蘇木精-伊紅染液，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.3 日糧

實(shí)驗(yàn)使用的日糧均為顆粒料，使用的小鼠基礎(chǔ)飼料(AIN-93M)和高脂飼料(D12451)由北京華阜康生物科技有限公司配制,其配方見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料(AIN-93M)和高脂飼料(D12451)配方

采用低、中、高的劑量方式，分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%、50%和100%，用CCSKO替換高脂飼料中的豬油：HF-25%CCSKO組(含21.91%CCSKO, CCSKO與豬油質(zhì)量比1∶3)、HF-50%CCSKO組(含43.83%CCSKO,CCSKO與豬油質(zhì)量比1∶1)、HF-100%CCSKO組(含87.66%CCSKO, CCSKO完全替代豬油)，高脂飼料中油脂的組成見表2。

表2 高脂飼料中油脂的組成 %

1.1.4 儀器與設(shè)備

BS223S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)，F(xiàn)orma 900series超低溫冰箱(美國(guó)賽默飛世爾公司)，ST16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾公司)，BS-380全自動(dòng)生化分析儀(中國(guó)邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，Ti倒置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與喂養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)使用100只3～4周齡的C57BL/6雄性小鼠，按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范飼養(yǎng)于江西省藥物研究所。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠飼喂于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠里，自由采食和飲水，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，濕度為40%～60%。適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)將小鼠分為兩組，10只小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，作為正常對(duì)照組(NC組)，90只小鼠飼喂高脂飼料，飼喂8周后，將體重大于NC組平均體重20%的小鼠定義為營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型小鼠，并用于之后的實(shí)驗(yàn)。造模完成后將模型組小鼠按體重采用隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分為5組，分別為高脂豬油組(HF組)(繼續(xù)飼喂高脂飼料)、基礎(chǔ)飼料恢復(fù)組(NR組)(作為陽(yáng)性對(duì)照組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，用于判斷實(shí)驗(yàn)組小鼠的減肥效果)、樟樹籽仁油和豬油混合組(HF-25%CCSKO組、HF-50%CCSKO組、HF-100%CCSKO組)，繼續(xù)喂養(yǎng)10周。NC組作為正常對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在麻醉狀態(tài)下測(cè)定小鼠的體重和體長(zhǎng)。摘眼球取血，置于高速冷凍離心機(jī)中以3 200 r/min離心12 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｐ∈蠼馄屎?，將睪周脂肪和腎周脂肪取出后立即稱重，迅速剪取小部分肝臟組織于保存液中，用于后續(xù)制作石蠟切片，其余部分以液氮冰凍，-80℃保存。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1BMI的測(cè)定

小鼠麻醉狀態(tài)下測(cè)定小鼠的體重，測(cè)量鼻到肛門的長(zhǎng)度為體長(zhǎng)，按照公式(1)計(jì)算BMI。

BMI=體重/體長(zhǎng)2

(1)

1.2.3.2 脂肪系數(shù)的測(cè)定

分離小鼠雙腎周圍脂肪組織和睪丸周圍脂肪組織，稱重。按照公式(2)計(jì)算脂肪系數(shù)。

脂肪系數(shù)=小鼠體內(nèi)各脂肪組織質(zhì)量/小鼠的體重×100%

(2)

1.2.3.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

取血清200 μL，采用BS-380全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)指標(biāo)。

1.2.3.4 肝臟切片染色觀察

采用蘇木精-伊紅(HE)染色法，取部分肝臟組織經(jīng)10%福爾馬林固定液固定、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色，染色切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像分析，觀察病理組織學(xué)變化。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 樟樹籽仁油對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體重、體長(zhǎng)、體脂的影響(見表3)

從表3可知，飼養(yǎng)10周后，隨著高脂飼料中CCSKO含量的增加，營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的終體重、BMI、腹部脂肪質(zhì)量、腹部脂肪系數(shù)呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。HF-25%CCSKO組BMI較HF組顯著降低；HF-50%CCSKO組的終體重、BMI、腹部脂肪質(zhì)量比HF組顯著降低；HF-100%CCSKO組的終體重、BMI、腹部脂肪質(zhì)量、腹部脂肪系數(shù)較HF組顯著降低，與NC組、NR組無顯著差異。即當(dāng)飼喂CCSKO替代25%豬油即CCSKO含量21.91%的高脂飼料時(shí)，營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的體重、腹部脂肪質(zhì)量降幅不顯著；當(dāng)飼喂CCSKO替代50%豬油即CCSKO含量43.83%的高脂飼料時(shí)，營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體的體重、BMI、腹部脂肪質(zhì)量降幅顯著；當(dāng)飼喂CCSKO替代100%豬油即CCSKO含量為87.66%的高脂飼料時(shí)，營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體的體重、BMI、腹部脂肪質(zhì)量降幅最大，已經(jīng)降至正常水平。這說明CCSKO減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積效應(yīng)與高脂飼料中CCSKO含量呈正相關(guān)性；只有當(dāng)高脂飼料中CCSKO替代豬油量大于等于50%即CCSKO含量大于等于43.83%時(shí)，CCSKO才具有顯著減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積和減輕體重作用。

注：同行不同字母代表P<0.05，即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。下同。

Clark等[9]研究發(fā)現(xiàn)MCTs與LCTs同時(shí)攝入時(shí)，MCTs可部分抑制LCTs的吸收。研究發(fā)現(xiàn)MCTs在體內(nèi)的水解、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝過程與豬油等LCTs不同[3,10-11]。MCTs進(jìn)入腸道后,完全水解為辛酸、癸酸, 辛酸、癸酸被小腸吸收后通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟細(xì)胞中辛酸、癸酸和部分月桂酸不依賴肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)體系直接進(jìn)入線粒體，進(jìn)行氧化產(chǎn)能；辛酸、癸酸和部分月桂酸可以抑制脂肪酸合成通路的關(guān)鍵酶(脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)等)的活性，激活體內(nèi)脂肪分解通路的關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子(激素敏感酯酶(HSL)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等)的活性，減少肥胖動(dòng)物的體內(nèi)脂肪沉積。因?yàn)镃CSKO含辛酸 0.3%～2.6%、癸酸51%～62%、月桂酸34%～40%，為天然癸酸月桂酸類MCTs，結(jié)合他人研究結(jié)果，推測(cè)CCSKO的作用機(jī)制與之類似，通過抑制長(zhǎng)碳鏈脂肪酸的吸收、脂肪酸合成以及激活體內(nèi)脂肪分解，達(dá)到減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積的效果。

2.2 樟樹籽仁油對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠血脂水平的影響(見表4)

由表4可以看出，喂養(yǎng)10周后，各CCSKO替代組與高脂組的血清TG水平無顯著性差異，表明高脂飼料中CCSKO各劑量替代豬油對(duì)高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠血清TG水平影響不大。

表4 樟樹籽仁油對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠血脂水平的影響(n=6)

MCTs對(duì)于血清TG水平的作用仍有爭(zhēng)議，有些研究認(rèn)為其有降低血清TG水平的作用[5]，有些研究認(rèn)為其有升高血清TG水平的作用[12]。預(yù)測(cè)CCSKO調(diào)節(jié)血清TG水平的機(jī)制是：MCFAs在乳糜微粒中的比例隨鏈長(zhǎng)增加而增加，隨飼喂時(shí)間延長(zhǎng)而增加，同時(shí)飼喂MCTs和LCTs可增加乳糜微粒中MCFAs的量[13]，CCSKO在消化過程中生成的部分月桂酸可能被酯化為甘油三酯并結(jié)合于乳糜微粒中，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液、脂肪和肝臟等組織，有提高血清TG水平、增加脂肪沉積趨勢(shì)。但CCSKO水解生成的癸酸有降低TG水平的作用，二者結(jié)合作用從而使其對(duì)TG影響不顯著。

血清TC增加是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素。HDL-C可通過促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等機(jī)制，實(shí)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化，被認(rèn)為是“好膽固醇”；而LDL-C是運(yùn)輸膽固醇到肝外組織的主要運(yùn)載工具，其水平升高會(huì)增加患動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性，被標(biāo)記為“壞膽固醇”[14]。分析 LDL-C/HDL-C 比值可預(yù)測(cè)心血管疾病嚴(yán)重程度，與血脂單項(xiàng)指標(biāo)相比，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。心血管疾病發(fā)病早期患者體內(nèi)血脂指標(biāo)出現(xiàn)輕微變化，而LDL-C/HDL-C 比值的變化更為顯著[15]。

由表4可知，隨著高脂飼料中CCSKO含量的增加，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。HF-25%CCSKO組血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平與HF組相比無顯著性差異。HF-50%CCSKO組的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平已經(jīng)降至與HF-100%CCSKO組無顯著性差異。HF-100%CCSKO組的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C 水平較HF組顯著降低，與NC、NR組無明顯差異。即當(dāng)飼喂CCSKO替代25%豬油即CCSKO含量21.91%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平降幅不顯著；當(dāng)飼喂CCSKO替代50%豬油即CCSKO含量43.83%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì)；當(dāng)飼喂CCSKO替代100%豬油即CCSKO含量為87.66%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠的血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平降幅最大，已降至正常水平。這說明CCSKO減少高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體內(nèi)血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C 水平與高脂飼料中CCSKO含量即CCSKO 替代豬油的量呈正相關(guān)性；只有當(dāng)高脂飼料中CCSKO 替代豬油量大于等于50%及以上即CCSKO含量大于等于43.83%時(shí)，CCSKO才具有降低高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體內(nèi)血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平的效果，達(dá)到克服豬油對(duì)心血管系統(tǒng)的危害，保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。

辛酸、癸酸通過促進(jìn)肝臟膽汁酸的合成和排泄，抑制小腸吸收膽汁酸、增加膽汁和糞便中膽固醇和膽汁酸的濃度，加速膽固醇代謝，從而降低血清TC、LDL-C的水平[16]。Roels 等[17]認(rèn)為膽固醇必須與膠束結(jié)合才能被吸收，膽固醇必須與LCFAs、乳糜微粒結(jié)合才能被運(yùn)輸，這兩個(gè)過程與LCFAs有關(guān)，而與MCFAs無關(guān)，MCFAs的增加可減少腸道內(nèi)膽固醇的吸收。Takahashi等[18]認(rèn)為MCFAs的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)與LCFAs不同，MCFAs直接離開小腸黏膜進(jìn)入血液，通過門靜脈系統(tǒng)直接進(jìn)入肝臟，不需被酯化為甘油酯并與膽固醇結(jié)合成乳糜微粒、通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制了膽固醇的吸收。推測(cè)CCSKO調(diào)節(jié)血清TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C水平的機(jī)制是：CCSKO水解產(chǎn)物——癸酸和月桂酸可以增加腸道內(nèi) MCFAs 水平，抑制豬油等LCTs吸收，從而減少腸道內(nèi)LCFAs。腸道內(nèi)MCFAs抑制膽固醇的吸收、加速膽固醇代謝，腸道內(nèi)與膽固醇結(jié)合的LCFAs的減少使被吸收和運(yùn)輸?shù)哪懝檀家矞p少，最終導(dǎo)致血液中膽固醇水平下降。

2.3 樟樹籽仁油對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠肝功能及肝臟組織的影響(見表5、圖1)

從表5可知，小鼠飼養(yǎng)10周后，隨著高脂飼料中CCSKO含量(CCSKO替換豬油的量)的增加，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠的血清ALT、AST水平呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。HF-25%CCSKO組ALT水平較HF組顯著降低。HF-50%CCSKO組ALT、AST水平較HF組顯著降低。HF-100%CCSKO組ALT、AST水平較HF組顯著降低，其降幅最大，已與NC、NR組無顯著性差異。即當(dāng)飼喂CCSKO替代25%豬油即CCSKO含量21.91%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠的血清AST水平降幅不顯著；當(dāng)飼喂CCSKO替代50%豬油即CCSKO含量43.83%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠血清ALT、AST水平降幅顯著；當(dāng)飼喂CCSKO替代100%豬油即CCSKO含量為87.66%的高脂飼料時(shí)，高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠體血清ALT、AST水平降幅最大，已降至正常水平。

由圖1可知：HF組和HF-25%CCSKO組小鼠的肝組織細(xì)胞脂滴浸潤(rùn)嚴(yán)重，肝脂變嚴(yán)重；HF-100%CCSKO組和HF-50%CCSKO組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，膽小管和毛細(xì)膽管未見異常，與NC組相似，無異常病變。

通過表5和圖1分析說明：CCSKO減少高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠血清ALT、AST水平與高脂飼料中CCSKO含量即CCSKO替換豬油的量呈正相關(guān)性；只有當(dāng)高脂飼料中CCSKO 替代豬油量大于等于50%即CCSKO含量大于等于43.83%時(shí)，CCSKO才可顯著減少高脂誘導(dǎo)型肥胖小鼠血清ALT、AST水平，明顯恢復(fù)肝功能，明顯減小肝臟脂變程度，與正常組無差異。

表5 樟樹籽仁油對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠肝功能的影響(n=6) U/L

高脂飲食導(dǎo)致的肥胖可引起肝臟組織形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞脂變。攝入MCTs能夠減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠肝臟的脂肪積累，減輕肝臟脂變，使肝臟恢復(fù)正常狀態(tài)[19]。相關(guān)肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)表明，MCFAs可以通過下調(diào)脂肪合成基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)脂肪氧化分解基因的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)TG聚集的狀態(tài)得到改善，緩解肝細(xì)胞的脂變程度[11]。 CCSKO改善營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠肝功能及肝臟組織的機(jī)制可能是：CCSKO 通過下調(diào)營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪合成基因的表達(dá)、上調(diào)脂肪氧化分解基因的表達(dá)，減少肝臟的脂肪積蓄，降低血清ALT、AST水平，改善細(xì)胞內(nèi)TG聚集的狀態(tài)，緩解肝細(xì)胞的脂變程度。

3 結(jié) 論

CCSKO為天然癸酸月桂酸類MCTs，其減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪蓄積、降低血脂水平效應(yīng)與高脂飼料中CCSKO含量即CCSKO替換豬油的量呈正相關(guān)性。飼喂CCSKO替代豬油量小于等于25%即CCSKO含量小于等于21.91%的高脂飼料, CCSKO 減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積、降低血脂水平效果不明顯。只有當(dāng)高脂飼料中CCSKO替代豬油量大于等于50%即CCSKO含量大于等于43.83%時(shí)，CCSKO才能顯著減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積、減輕體重、降低血脂水平、修復(fù)豬油等LCTs造成的肝臟損傷。

CCSKO與辛酸癸酸類MCTs相比較，CCSKO減少營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)脂肪蓄積、降低血脂水平的作用機(jī)制，可能既有相同之處、也有不同之處。相同之處可能是： CCSKO與辛酸癸酸類MCTs代謝途徑類似，以及對(duì)脂代謝相關(guān)酶的調(diào)節(jié)作用。不同之處可能是：部分月桂酸可能被酯化為甘油三酯并結(jié)合于乳糜微粒中，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液、脂肪和肝臟等組織，有增加脂肪沉積、提高血清TG水平趨勢(shì)。