青錢柳黃酮類成分不同提取方法及藥理活性研究

李俊秀 廖夏云,2 趙立春,2﹡ 楊濤,2

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaja ] 別名青錢李、麻柳、搖錢樹、山化樹、一串錢、山麻柳、甜茶樹等，系胡桃科、青錢柳屬植物[1]。分布于我國南方多省地海拔420～2500m的山區(qū)、溪谷、石灰?guī)r山地[2]?！吨袊兴庂Y源志要》中記載：青錢柳葉和皮均可入藥，具有止痛、清熱解毒等功效，用于治療頑癬[3]。高血糖癥現(xiàn)已成為人類的第二大殺手，而由青錢柳芽葉制成的茶在“三高癥”人群的防治中有良好效果。青錢柳茶也成為我國首個(gè)被美國FDA認(rèn)證的抗高血糖保健茶[4]。研究者對(duì)青錢柳化學(xué)成分進(jìn)行提取、分離和純化發(fā)現(xiàn)：青錢柳提取物除含豐富的礦質(zhì)元素外，其化學(xué)成分主要有黃酮類、多糖、甾體類、內(nèi)酯、皂苷、氨基酸等，尤以黃酮類化合物含量較為豐富[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究表明：青錢柳提取物有多種保健功能，能降血糖、降血壓、降血脂、增強(qiáng)細(xì)胞免疫、抗氧化、防衰老、抗癌等[8-13]。黃酮化合物在青錢柳提取物藥效成分中占一定比例。植物黃酮的諸多功效應(yīng)用在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有其獨(dú)特的優(yōu)勢，因此，對(duì)黃酮類化合物的研究對(duì)于青錢柳藥用價(jià)值的開發(fā)和利用具有重要意義。筆者通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料，綜述青錢柳黃酮的成分組成、測定方法、提取方法以及活性研究進(jìn)展，為青錢柳黃酮的進(jìn)一步研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 青錢柳黃酮類化學(xué)成分

黃酮類化合物是青錢柳的主要化學(xué)和活性成分之一。研究者利用各種色譜技術(shù)對(duì)青錢柳化學(xué)成分分離和純化，并通過物理化學(xué)和波譜等鑒定技術(shù)手段，目前已鑒定并報(bào)道的青錢柳黃酮單體達(dá)40多種，主要為黃酮醇及其苷類結(jié)構(gòu)，與苷元結(jié)合的糖有葡萄糖、甘露糖和鼠李糖等。結(jié)果見表1、圖1。

表1 已鑒定的青錢柳黃酮單體

圖1 化合物1～46的結(jié)構(gòu)

2 青錢柳黃酮類成分的測定

2.1 紫外可見分光光度法 黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)中有A環(huán)(苯甲酰基系統(tǒng))和B環(huán)(桂皮酰基系統(tǒng))兩個(gè)交叉共軛體系，分別在240～280 nm(帶Ⅰ)和300～400 nm(帶Ⅱ)之間產(chǎn)生兩個(gè)紫外吸收譜帶。因黃酮苯環(huán)上多有取代酚羥基，堿性條件下兩個(gè)紫外吸收譜帶可出現(xiàn)紅移。利用此光譜性質(zhì)，采用分光光度法在其紫外波譜的λmax處可測定總黃酮含量。目前文獻(xiàn)報(bào)道的運(yùn)用紫外分光 光度法測定青錢柳總黃酮含量，多以蘆丁為對(duì)照品，以三氯化鋁為顯色劑[28-29]，或以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系為顯色劑[30]，顯色后用分光光度計(jì)在一定波長處測定。值得注意的是，一些黃酮類化合物(異黃酮、黃烷酮、兒茶素等)在可見光區(qū)與AlCl3作用不顯色可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏??；而以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系時(shí)，在500nm波長處某些黃酮類成分(黃芩素、橙皮苷、槲皮素、山奈酚等)吸收很弱，但某些非黃酮類成分(綠原酸、原兒茶酸等)有最大吸收，使硝酸鋁顯色法專屬性不強(qiáng)，準(zhǔn)確性較差。李富民等[31]曾以蘆丁和槲皮素為對(duì)照品，對(duì)三氯化鋁顯色法(測定波長410 nm)和硝酸鋁顯色法(測定波長500nm)進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)比較，結(jié)果得出AlCl3顯色法是比Al(NO3)3顯色法更精確、快速的含量測定方法，更適合于青錢柳總黃酮含量測定的結(jié)論。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)具有分離效果好、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、分離分析速度快、儀器自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物尤其是單體化合物的含量分析。將樣品溶液注入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行在線分離和檢測，利用外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、面積歸一化法等方法，測定指標(biāo)成分的含量。對(duì)多組分的含量測定則需利用校正因子或轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，換算出樣品中總黃酮的含量。表2列出了近年利用HPLC法分析青錢柳黃酮含量的相關(guān)研究，可見HPLC法為測定青錢柳黃酮成分含量、建立青錢柳指紋圖譜、篩選藥用青錢柳優(yōu)良產(chǎn)地、確定青錢柳的最佳采收期，對(duì)青錢柳進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制等提供了快速、可靠的分析手段。

表2 HPLC法分析青錢柳黃酮的相關(guān)研究

續(xù)表2 表2 HPLC法分析青錢柳黃酮的相關(guān)研究

3 青錢柳黃酮類成分的提取

3.1 溶劑提取法 溶劑提取法中水提法適用親水性黃酮類化合物，如水溶性黃酮苷類的提取。因水提法的提取效率低、提取物中極性雜質(zhì)多、分離提純困難而不常用。堿提取酸沉淀法應(yīng)用在含弱酸性酚羥基的黃酮類化合物的提取上比起醇提法更具安全、便捷、成本低等優(yōu)勢，其提取基本流程：青錢柳樣品→加入適量硼砂、堿性飽和石灰水提取→提取液PH值調(diào)至酸性→提取液加入乙酸乙酯、正丁醇分別萃取→萃取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干→青錢柳總黃酮。得率與固液比、堿提取液PH值、硼砂用量、提取時(shí)間、酸沉PH值等因素有關(guān)，可采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響因素的工藝參數(shù)[36]。

有機(jī)溶劑提取法是提取黃酮類成分的經(jīng)典方法，比較容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，常用的有機(jī)溶劑為乙醇。鄧佑林等[37]采用索氏提取器加熱回流提取青錢柳總黃酮，比較了不同濃度乙醇和水為溶劑下的提取效果，結(jié)果以水為溶劑時(shí)提到的黃酮含量只有乙醇的一半，證明乙醇對(duì)青錢柳黃酮的溶出效率高。乙醇提取具有無毒、提高黃酮類成分溶解性等優(yōu)點(diǎn)，但提取時(shí)間長、溶劑耗量較大、提取液需進(jìn)一步處理。

3.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取具有操作簡單，耗能少，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用是建立在溶劑提取的基礎(chǔ)上，因超聲波可加快青錢柳細(xì)胞壁的破裂，減少提取時(shí)間，從而提高黃酮提取效率；同時(shí)該方法提取時(shí)不需要較高的溫度，可避免黃酮類化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞，被廣泛應(yīng)用。作為一種常用的中藥活性成分提取方法，超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、提取溶劑、用量等均能影響青錢柳總黃酮提取率，不同因素對(duì)其提取率的影響作用大小不盡相同。吳茹[38]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了影響乙醇超聲提取青錢柳總黃酮的各因素工藝參數(shù)，得到提取率的影響因素作用大小依次為：超聲功率、乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比。優(yōu)化的工藝參數(shù)為：乙醇濃度48%；料液比1∶34g·mL-1；超聲功率162W；超聲時(shí)間41min。該條件下提取率達(dá)8.427%。

3.3 微波輔助提取法 微波提取法是利用微波能量加快藥物分子熱運(yùn)動(dòng)，從而加速破壞細(xì)胞壁使有效成分更快提取出來的方法。楊武英等[39]研究了微波輔助法提取青錢柳葉總黃酮，數(shù)據(jù)分析表明，微波功率是影響微波輔助提取青錢柳葉總黃酮得率的最主要因素。最佳提取工藝參數(shù)為：40%乙醇；料液比1∶40g·mL；微波功率2100W；提取時(shí)間25min。此條件下，青錢柳葉總黃酮提取率為5.60%。微波法作前處理，比一般方法溶劑耗量少，時(shí)間短，得率高。

3.4 酶解法 利用酶對(duì)大分子物質(zhì)的分解作用，在原料中加入合適的酶使細(xì)胞壁和間質(zhì)中的纖維素、果膠等大分子物質(zhì)完全分解，黃酮物質(zhì)被充分釋放出來后，再對(duì)其進(jìn)行提取，能大大提高提取效率。柯福星[40]采用酶法-超聲波輔助提取青錢柳葉中總黃酮，根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝為：0.4g.100mL-1的木瓜蛋白酶水溶液作為提取劑；溫度58℃；超聲波功率400W；提取時(shí)間70min。柳旭光等[41]以纖維素酶解法提取青錢柳黃酮，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化影響因素參數(shù)，在酶解時(shí)間32.28min；溫度41℃；加酶量0.57%；緩沖液pH 6.37的條件下提取效率最佳，青錢柳總黃酮提取得率達(dá)9.227%。酶法與別的提取方法聯(lián)用，提取量顯著高且活性成分保存好。

3.5 其他提取方法 深共晶溶劑是一種新型的離子溶劑，具有低廉、易合成、安全性高、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。其顯著的物理化學(xué)和生物降解性能使它們成為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的替代品。ShangXC等[42]研究超聲輔助-深共晶溶劑萃取法(UAE-DES)提取青錢柳葉中黃酮類化合物，試驗(yàn)了九種基于兩種或三種組分的DES體系，篩選出合適青錢柳黃酮化合物提取的工藝，DES可作為生物活性化合物的可持續(xù)提取介質(zhì)，該法是一種較好的從青錢柳葉中選擇性提取黃酮類化合物的方法。

微生物發(fā)酵技術(shù)是利用微生物生長過程中產(chǎn)生的代謝物酶，分解破環(huán)植物細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，使有效成分較大程度的溶出，該法具有提取物穩(wěn)定、純度高、反應(yīng)條件溫和、有機(jī)溶劑使用量少等優(yōu)點(diǎn)。將微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到青錢柳黃酮提取(工藝流程：青錢柳葉干燥、粉碎→酶解→高溫滅菌→接種→發(fā)酵提取→過濾→青錢柳黃酮)，得率遠(yuǎn)高于超聲提取和有機(jī)溶劑提取[43]，是一種經(jīng)濟(jì)有效、快速提取的方法，大大提高青錢柳黃酮的提取率和原料利用率。

將近幾年選擇不同提取方法得到的青錢柳黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝條件列于表3。由于原料的產(chǎn)地、處理方法的不同，各提取方法提取的青錢柳黃酮得率存在一定差異，提取方法的優(yōu)越性僅根據(jù)黃酮得率高低來判斷意義不大，還應(yīng)從黃酮的純度和活性方面綜合考慮，建議根據(jù)研究的目的、要求、條件及環(huán)境選擇適宜的提取方法。

表3 青錢柳總黃酮不同提取方法研究

4 青錢柳黃酮類成分活性研究

黃酮類化合物是青錢柳的 主要活性成分之一。對(duì)青錢柳黃酮生理活性及作用的研究如下(表4)。

4.1 降血糖 糖尿病治療機(jī)制主要有促進(jìn)胰島素分泌、增加胰島素敏感性、減輕胰島素抵抗、抑制α糖苷酶等，青錢柳黃酮降血糖機(jī)理的研究也主要從調(diào)節(jié)血糖水平、改善胰島細(xì)胞功能、改善胰島素抵抗和免疫調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行。

鏈脲佐菌素對(duì)胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，導(dǎo)致胰島素分泌不足。對(duì)鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病大鼠用青錢柳總黃酮連續(xù)給藥，可降低糖尿病大鼠空腹血糖、提高血胰島素水平、減緩體重下降，并且能改善其肝腎功能，推測降血糖的原因可能是糖尿病大鼠中殘存的胰島細(xì)胞被青錢柳總黃酮成分激活有關(guān)[46]。前脂肪細(xì)胞分化能使多種相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生變化，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，提高脂肪組織細(xì)胞的敏感性；HepG2細(xì)胞具有表達(dá)胰島素樣生長因子和胰島素受體的代謝反應(yīng)。它們對(duì)胰島素抵抗是引起糖脂代謝紊亂的重要原因。對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型和HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的研究結(jié)果表明：青錢柳總黃酮能明顯促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化，改善胰島素抵抗作用，提高胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞和HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量[47-48]。通過體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)，揭示青錢柳黃酮成分的降血糖機(jī)制還與抑制α-葡萄糖苷酶活性，延緩餐后血糖升高有關(guān)[49]。

4.3 抗菌活性 黃酮類化合物屬于酚類衍生物，pH偏酸性，能讓菌類蛋白質(zhì)凝固或變性，使其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致微生物產(chǎn)生功能性障礙，生長被抑制或菌體死亡。體外抗菌實(shí)驗(yàn)常用方法有稀釋法、濾紙片法、打洞法、管蝶法等，濾紙片法操作簡單、結(jié)果直觀、重復(fù)性好、成本低，是最常用的方法。采用濾紙片擴(kuò)散法研究青錢柳黃酮對(duì)常見的腐敗菌種(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等)的抑菌效果，通過測定抑菌圈的各項(xiàng)指標(biāo)，馮宗帥[50]的研究結(jié)果顯示對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC分別為25 mg/mL、28 mg/mL；37 mg/mL、40 mg/mL和40 mg/mL、40 mg/mL。Lei X等[32]的實(shí)驗(yàn)研究顯示青錢柳黃酮濃度高于40 mg/mL時(shí)，抑菌和殺菌效果好，純化后的青錢柳葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)，其次是沙門氏菌，對(duì)大腸桿菌的抑制能力最弱。

4.4 抗急性肝損傷 肝損傷是各種肝臟疾病共同的病理環(huán)節(jié)，急性肝損傷(ALF)的特征是突然出現(xiàn)肝功能障礙、凝血障礙和腦病。目前已知多種外源性藥物可引起肝毒性和急性肝衰竭，四氯化碳(CCl4)和D-半乳糖胺(D-GalN)是常用的誘發(fā)化學(xué)性肝損傷模型的化學(xué)藥物，模型病理特征穩(wěn)定可靠，在病理學(xué)改變與生物化學(xué)變化方面與人化學(xué)性肝損傷相似。Xie JH等[51]對(duì)四氯化碳導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)用青錢柳黃酮處理能較好地降低ALF小鼠血清ALT和AST水平(P<0.01)，同時(shí)降低肝勻漿中丙二醛(MDA)的含量，顯著升高超氧化物歧化酶(SOD)活力和總抗氧化能力(T-AOC)。對(duì)脂多糖和D-半乳糖胺((LPS/D-GalN)聯(lián)合誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠給予青錢柳黃酮處理(100 mg / kg、200 mg / kg、400 mg / kg)，均能有效提高ALF小鼠的存活率[52]，青錢柳黃酮通過抑制ALT和AST水平，減輕氧化應(yīng)激，改善肝形態(tài)，降低小鼠肝細(xì)胞凋亡，有效預(yù)防和治療CCl4和D-GalN誘導(dǎo)的ALF。

4.5 調(diào)節(jié)腸道微生物 黃酮類化合物生物利用度較低，青錢柳總黃酮口服后大部分留在大腸內(nèi)累積，對(duì)腸道微生物具有調(diào)控作用，影響某些代謝途徑，對(duì)某些疾病具有潛在的治療作用，有助于改善人類健康。肥胖是一個(gè)嚴(yán)重的全球性健康問題，是許多危及生命的疾病發(fā)生或發(fā)展的危險(xiǎn)因素，肥胖人群中厚壁菌門與擬桿菌門的比例(F/B)高于瘦人，通過對(duì)高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的肥胖小鼠給予青錢柳總黃酮(CPF)治療8周后，發(fā)現(xiàn)HFD組體重明顯大于HFD-CPF組，F(xiàn)/B值有明顯下降(P<0.05)，表明青錢柳黃酮對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖具有調(diào)節(jié)保護(hù)作用[53]。此外，通過體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究[54]，青錢柳黃酮能改變腸道內(nèi)菌體的組成，增加有益菌群雙歧桿菌、乳酸菌的繁殖，并抑制擬桿菌、梭狀菌的生長，而對(duì)總體菌群數(shù)量基本沒有影響。青錢柳黃酮具有益生元活性，可能與其發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的抗氧化作用，從而為腸道有益菌群提供了更有利的生長和繁殖環(huán)境有關(guān)。

表4 青錢柳黃酮的生物活性

續(xù)表4 表4 青錢柳黃酮的生物活性

5 總結(jié)與展望

青錢柳在治療“三高癥”、抗氧化等方面有顯著的效果，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。由青錢柳葉加工成的茶具有良好的保健功效被廣泛認(rèn)可，同其他品種茶葉相比，青錢柳葉中黃酮類成分的含量較高。目前，研究者對(duì)青錢柳化學(xué)成分的提取分離及活性研究方面已取得不錯(cuò)的進(jìn)展，對(duì)青錢柳的進(jìn)一步深入研究、原材料質(zhì)量評(píng)價(jià)、相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)及資源合理利用等方面提供了豐富的理論依據(jù)。但關(guān)于青錢柳黃酮類成分的研究仍不足：

①關(guān)于青錢柳黃酮提取的研究較多，而純化方面的研究較少，且研究不夠系統(tǒng)，僅停留在實(shí)驗(yàn)階段，今后可學(xué)習(xí)借鑒其他天然產(chǎn)物中黃酮的提取純化技術(shù)，創(chuàng)新其提取純化工藝，以達(dá)到高效、快速、低成本、利于規(guī)模化生產(chǎn)的目的。

②目前在青錢柳黃酮類成分藥理活性和作用機(jī)制的研究方面，多是對(duì)其總提取物和總成分進(jìn)行研究，而對(duì)單體尤其是新分離出的單體化合物的研究不足，應(yīng)進(jìn)一步深入開展單體的藥效和構(gòu)效關(guān)系的研究，以便闡明青錢柳黃酮發(fā)揮藥理作用的具體成分和作用機(jī)理。

③青錢柳黃酮類化合物主要以糖苷的形式存在，不同黃酮母核與糖元結(jié)合的種類、數(shù)量、結(jié)合位點(diǎn)和方式都可能影響其藥理活性；另外，青錢柳黃酮類單體成分仍有很多沒有被分離鑒定出來，故在未來的研究中，應(yīng)加速青錢柳黃酮單體的精細(xì)分離和結(jié)構(gòu)解析，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分類匯總、對(duì)比活性研究，對(duì)不斷闡明和挖掘其潛在的構(gòu)效關(guān)系，尋找具有針對(duì)性和高效性的黃酮類先導(dǎo)化合物以及進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化均有重要意義。

④青錢柳黃酮類成分含量較高，但目前已開發(fā)的產(chǎn)品在市場上僅以茶葉、飼料為主，青錢柳黃酮的諸多功效未能得到充分開發(fā)和利用，相信隨著研究的不斷深入推進(jìn)，更多療效明確的青錢柳黃酮保健產(chǎn)品和藥品將被開發(fā)出來，在發(fā)展人民的健康事業(yè)和發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)上青錢柳有廣闊的前景。