加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響

楊登科 郭奕妤 秦建平 徐 杰 黃蘭蘭 陸 毓 吳 潔

昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病[1]。臨床上常反復(fù)難愈，影響患者生活質(zhì)量。從病理學(xué)上看，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細(xì)胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤是銀屑病的3個(gè)最主要的特點(diǎn)[3]。研究表明，在銀屑病的炎癥反應(yīng)中，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17等對(duì)炎癥免疫有著至關(guān)重要的作用[3]。本病屬中醫(yī)“白疕”的范疇。筆者應(yīng)用加味凈屑飲治療血熱證尋常型銀屑病，取得良好臨床療效[4]，為進(jìn)一步為臨床使用提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，筆者進(jìn)一步研究加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來源，種系，品系：BALB/c小鼠，7～8周齡，體重20～22 g，雌性，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2008-24。上述動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)一周后使用。溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。

1.2 藥物與試劑 加味凈屑飲組成(60 kg成人劑量)：水牛角粉30 g，生地15 g，紫草15 g，白鮮皮15 g，漏蘆根15 g，雞血藤15 g，白花蛇舌草20 g，茜草根10 g，威靈仙10 g，蒼術(shù)10 g，板藍(lán)根15 g，苦參15 g，玄參15 g，昆明山海棠15 g等，藥物來自于昆明市中醫(yī)醫(yī)院中藥房。加入10倍的水，浸泡30 min，然后煎煮3次，合并煎煮液，紗布過濾、離心后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，最后濃縮成浸膏， 稱取質(zhì)量，折合原藥材1g浸膏相當(dāng)于2.57 g生藥。根據(jù)人與動(dòng)物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量，制定出給藥濃度。咪喹莫特乳膏購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)190801)，地塞米松片購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)1509202)，IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國Invitrogen公司(生產(chǎn)批號(hào)210754003)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 離心機(jī)來自德國Thermo Scientific Heraeus；石蠟切片機(jī)、組織包埋機(jī)、烘片機(jī)、DM2500正置顯微鏡、全自動(dòng)組織脫水機(jī)均購置德國萊卡儀器有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 48只BALB/c雌性小鼠，平均體重18～20 g，將其隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、模型組、加味凈血飲低、中、高劑量組(分別為相當(dāng)于生藥3 g/kg、6 g/kg和12 g/kg)及地塞米松陽性對(duì)照組(2 mg/kg)，每組8只。將小鼠耳部的被毛小心剃去，將5%的咪喹莫特乳膏均勻涂抹于耳部，用藥量為10 mg，1次/d，連續(xù)用藥5 d?？瞻讓?duì)照組涂抹相同體積的蒸餾水。給藥組灌胃給予相應(yīng)加味凈血飲，灌胃體積為0.4 mL/只，空白對(duì)照組、模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.4.2 左耳厚度檢測(cè) 使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠背左耳皮膚厚度，測(cè)量3次，取平均值，于給藥第1天、第3天、和第5天下午3點(diǎn)測(cè)量左耳厚度。

1.4.3 HE染色法觀察皮膚的病理損傷程度 取材之后標(biāo)本放入4%的多聚甲醛溶液中固定，通過包埋，切片，烘干，脫蠟，水化，HE染色等步驟制成透明的組織切片，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚的組織結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤情況，并用數(shù)碼相機(jī)采集圖像。

1.4.4 ELISA法模型小鼠血清中的IL-17產(chǎn)生水平 收集血清樣本，采用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中的IL-17細(xì)胞因子的水平，各步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著造模時(shí)間推移，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠左耳厚度顯著增加，在第3天和第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，地塞米松陽性對(duì)照組和加味凈屑飲高劑量組藥物干預(yù)于第3天和第5天顯著降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1。

組別劑量/g/kgDay1厚度/mmDay3 厚度/mmDay5 厚度/mm空白對(duì)照組-14.00±1.6914.50±1.5914.25±1.39模型組-13.75±0.7124.42±2.81##28.50 ±3.17##陽性對(duì)照組2mg/kg14.25 ±1.5819.86 ±3.09?21.88 ±3.00??低劑量組314.75±1.2821.85±3.1027.71±3.45中劑量組615.12±1.9624.50±2.7225.56±2.92高劑量組1214.62 ±1.3019.51 ±1.60??22.65 ±2.50??

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01，與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳病理損傷的影響 HE 染色顯示，空白對(duì)照組小鼠耳部皮膚表皮層菲薄，細(xì)胞形態(tài)正常。與空白對(duì)照組比較，模型組耳朵皮膚明顯增厚，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；與模型組比較，地塞米松陽性對(duì)照組和加味凈屑飲不同劑量組藥物干預(yù)，顯著降低皮膚厚度，炎癥細(xì)胞浸潤減少，陽性對(duì)照組和高劑量組效果更好。如圖1所示。

3.3 加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠IL-17產(chǎn)生水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-17顯著升高；與模型組比較，加味凈屑飲高劑量組藥物干預(yù)下調(diào)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠血清Th17細(xì)胞細(xì)胞因子(IL-17)的表達(dá)水平，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如圖2所示。

4 討論

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。屬于中醫(yī)學(xué)“白疕”的范疇。清《醫(yī)宗金鑒》指出白疕“固由風(fēng)邪客皮膚，亦由血燥難榮外”。歷代醫(yī)家多從血論治銀屑病，蜀中中醫(yī)外科名家吳軍教授認(rèn)為本病病機(jī)為素體陽熱偏盛，外受風(fēng)濕熱邪侵襲，內(nèi)外邪氣搏結(jié)于血分，至血熱風(fēng)燥，肌膚失養(yǎng)而成白疕。治療以清熱涼血、除濕解毒、祛風(fēng)潤燥為主。

加味凈屑飲是在吳軍老師凈屑飲基礎(chǔ)上加減化裁而成，方中水牛角粉清熱解毒，涼血散瘀；玄參清熱涼血，滋陰解毒共為君藥；生地清熱涼血，滋陰解毒；紫草涼血活血，解毒生??；漏蘆根清熱解毒散結(jié)，共為臣藥。白鮮皮清熱燥濕，祛風(fēng)解毒；昆明山海棠祛風(fēng)除濕，活血止血；茜草根涼血止血，疏風(fēng)通絡(luò)；苦參清熱燥濕，涼血解毒；威靈仙祛風(fēng)濕；蒼術(shù)祛風(fēng)解表，健脾燥濕；板藍(lán)根清熱解毒，涼血利咽，上藥共為佐藥；雞血藤行血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)，能“治風(fēng)毒通血脈”，為使藥。全方共奏清熱涼血、除濕解毒、祛風(fēng)潤燥之功。

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為免疫紊亂是銀屑病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。最新的研究表明IL-23/Th17免疫調(diào)節(jié)通路在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。Th17細(xì)胞及下游細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等導(dǎo)致銀屑病的炎癥反應(yīng)而至發(fā)病。咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型皮損特點(diǎn)、病理學(xué)特征及細(xì)胞因子改變都與銀屑病相似，與銀屑病進(jìn)行期病理變化基本一致，基本符合中醫(yī)銀屑病血熱證表現(xiàn)[6]。故本研究選用了咪喹莫特誘導(dǎo)BALB /c雌性小鼠作為銀屑病模型。前期研究發(fā)現(xiàn)加味凈屑飲顯著降低銀屑病患者PASI評(píng)分和DLQI評(píng)分，顯示出較好的臨床療效。本次研究通過構(gòu)建咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠，進(jìn)一步觀察加味凈屑飲干預(yù)銀屑病小鼠模型的組織病理改變和對(duì)Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的影響，結(jié)果顯示，加味凈屑飲高劑量藥物干預(yù)顯著降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度，減少左耳炎癥細(xì)胞的浸潤，下調(diào)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠血清Th17細(xì)胞細(xì)胞因子(IL-17)的表達(dá)水平。初步結(jié)果顯示，加味凈屑飲可能通過抑制IL-17產(chǎn)生水平介導(dǎo)治療銀屑病，然而具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。