活性多糖提取純化及結構解析的研究進展

劉艷紅 唐 祥 李婭琳 鄒 瓊 伍曉萍 陳 彤

昆明醫(yī)科大學藥學院 云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500

多糖(polysaccharide)是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子化合物，廣泛存在于自然界中，參與生命體的多個生理活動過程，如纖維素、肽聚糖參與構成細胞壁，淀粉、糖原等作為養(yǎng)分，參與動植物的整個使命過程。

通常能調(diào)節(jié)人體生理功能的特異性多糖稱之為活性多糖，具有免疫調(diào)節(jié)[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、降血糖[7]等多種活性。因其來源廣泛，安全性高，活性多糖具有較高的開發(fā)潛力。多糖是大分子物質(zhì)，結構復雜，獲得高純度多糖是進行結構解析的前提，而對多糖結構進行解析又是構效關系研究的起點。目前所用結構解析方法僅能得到局部的信息，對于多糖結構的確證仍是一個需要突破的難點。因此本文就活性多糖的提取、分離純化和結構解析方法做一綜述。

1 多糖的提取

1.1 水提醇沉 多糖為極性大分子化合物，易溶于熱水，不溶于乙醇，丙酮等溶劑，因而水提醇沉法是提取多糖最常用的方法。該方式所需設備簡單，溶劑價廉易得且易于回收，廣泛用于多糖的提取及初步純化。趙嵩月等[8]用水提醇沉法從三七廢渣中提取得到含量為56.70%的三七粗多糖。

1.2 酸堿法 酸提取法以稀鹽酸或稀醋酸為提取溶劑，用濃度為0.10～0.15 mol/L的鹽酸溶液提取多糖，所得多糖活性、得率均較高[9-10]。但因糖苷鍵在酸性環(huán)境中易斷裂，會影響多糖的活性及結構解析，故而該方法現(xiàn)已較少使用。堿液有助于多糖的浸出，提高多糖得率，常用濃度為0.1～10 mol/L氫氧化鈉溶液提取多糖[11-12]，但堿液對容器腐蝕性較強，且所提多糖黏性大，不適于工業(yè)生產(chǎn)。

1.3 酶提取法 酶提取法就是選擇適宜的酶，將細胞壁酶解，使胞內(nèi)多糖溶出，常用于提取多糖的酶有纖維素酶，蛋白酶，果膠酶等。該方法能極大地提高多糖得率和縮短提取時間，且該方法通常在較溫和的條件下進行，對多糖結構影響較小。楊佳琦等[13]用復合酶法提取云芝多糖，得率較水提醇沉法提高了43.63%。但因酶具有高度專一性，選擇適宜的酶就顯得尤為重要。同時提取的溫度，pH，時間均會影響提取效率，且酶價格較昂貴，用量大，極大地限制了該方法的使用。

1.4 物理提取法 常用的物理提取法包括超聲提取法和微波提取法。超聲波能增加溶劑的穿透力，可縮短提取時間，提高提取效率。Mehdi Alboofetileh等[14]以196W的超聲波提取褐藻多糖，可使得率提高至3.51%。微波可使溶劑迅速氣化，進而在細胞膜和細胞壁上形成大量孔洞，有利于胞內(nèi)多糖釋放，以微波功率700 W，20 min/次，提取兩次，可使多糖得率達15.75%[15]。超聲和微波提取法常協(xié)同用于多糖提取[16]，但上述兩種方法需要配備專門的儀器設備，且能耗較大，使用率遠遠不及水提醇沉法。

近年來發(fā)展了一些新的提取技術，如超臨界流體萃取法[17-18]、高壓脈沖法[19]等，但由于需要特殊設備，使用率不如傳統(tǒng)方法高。

2 多糖的純化

2.1 多糖脫蛋白

2.1.1 Sevage法 提取得到的粗多糖常含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在有機溶劑中易變性，Sevage法可用于多糖脫蛋白。當氯仿：正丁醇比例為4:1時，蛋白去除效果較好[20-21]。Sevage法反應條件溫和，能較好的避免多糖降解，但該法需重復操作多次，才能獲得較高的蛋白脫除率，但多糖損失量較大，操作也較繁瑣。

2.1.2 三氯乙酸法 三氯乙酸(TCA)也是常用的蛋白沉淀試劑，蛋白的脫除率和多糖的損失率與TCA用量密切相關。Chen L等[22]發(fā)現(xiàn)用10% TCA可較好去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，當多糖提取液與TCA的比例為1∶3，TCA濃度為6%時，蛋白質(zhì)脫除率可達84.16%[23]。TCA法操作簡單，所需試劑相對單一，蛋白脫除率及多糖保留率均高于Sevage法[24]，可以對大批量多糖進行處理，但該方法的反應較為劇烈，應控制好條件，避免TCA對多糖結構的影響。

2.1.3 酶解法 蛋白質(zhì)除以游離蛋白的形式存在外，還與多糖形成糖蛋白復合物，而復合物用Sevage法及TCA法都較難完全去除。特異性蛋白酶可水解蛋白質(zhì)，從而達到脫除蛋白質(zhì)的目的。常用的酶有中性蛋白酶[25]、木瓜蛋白酶[26]、纖維素酶、果膠酶[27]等，可單獨使用，也可以復合酶的形式用于脫蛋白。酶解法專一性強，不易造成有機試劑的污染，蛋白脫除效果較好。

除了上述傳統(tǒng)方法外，還有三氟三氯乙烷法、氫氧化鈉法、鹽酸法、鞣酸法、氯化鈉法、氯化鈣法、乙酸鉛法、反復凍融法、陰離子交換樹脂法、徑向流動色譜法等，同時多種方法的聯(lián)用為多糖提取液更好脫除蛋白提供了更多的可能。

2.2 多糖脫色素 多糖提取液通常顏色較深，影響產(chǎn)品外觀及進一步的純化，常需選擇適宜的方法去除色素。常用的脫色方法包括活性炭吸附法，過氧化氫法，大孔樹脂法等?；钚蕴烤哂卸嗫捉Y構，對芳香族有機物具有較強的吸附性[28]，該法條件較為溫和，應用范圍廣，但活性炭加入量、溶液pH值、脫色溫度、時間等直接影響脫色效果。過氧化氫對酚類、羥基蒽醌衍生物類色素有較好的去除效果，但過氧化氫的氧化性較強，若用量過大，反應時間較長，有可能會破壞多糖的結構。大孔樹脂性質(zhì)穩(wěn)定，對多種色素、蛋白質(zhì)均有不同程度的吸附性，在脫色的同時對蛋白質(zhì)也有一定的去除作用。大孔樹脂型號眾多，選擇適宜的型號有助于提高色素脫除率及多糖保留率，常用的有NKA-9、AB-8、D303、D101、D941、HPD-100等。

2.3 多糖的純化

2.3.1 沉淀法 不同組分多糖往往具有不同的分子量，在不同的溶液中具有不同的溶解性，因而可以根據(jù)溶解特性進行分離純化。包括乙醇分步沉淀法，鹽析法等。乙醇分步沉淀法是最常使用的沉淀法，增加乙醇的濃度，多糖按分子量從大到小依次被沉淀。鹽析法通常是在多糖提取液中加入中性鹽(如氯化鈉，氯化鉀，硫酸銨等)后使其達到一定濃度，此時在鹽溶液中溶解度最小的多糖將會先沉淀出來，然后繼續(xù)升高上清液中的鹽濃度，則另一多糖又將沉淀，依次進行分離，但沉淀法僅適合于溶解度相差較大的多糖組分。

表1 多糖脫色常用大孔吸附樹脂

2.3.2 膜分離法 膜分離技術是一項高效分離技術，也是基于多糖各組分分子量差異而進行分離。分離過程以不同截留分子量的膜為分離介質(zhì)，在膜兩側施加推動力，使待分離液體中各組分選擇性通過膜。根據(jù)膜的孔徑大小可分為微濾、超濾、納濾和反滲透，超濾技術因其截留的分子量范圍在2-300kDa，被用于多糖的分離純化[34-35]。研究表明，截留分子量為50和300 kDa的陶瓷超濾膜對香菇多糖提取液有較好的分級效果[33]。膜分離法條件溫和，不會對多糖結構造成影響，且分離量較大，不需要額外的試劑，尤其適用于工業(yè)大生產(chǎn)中多糖的純化。

2.3.3 色譜分離法 根據(jù)分離原理的不同，可將柱色譜法分為離子交換柱色譜法和凝膠柱色譜法。酸性多糖帶負電，可用陰離子交換柱層析將其與中性多糖相分離，同時可控制洗脫液的離子強度將帶電性不同的酸性多糖進行分離(分離原理如圖1 A所示)。最常用的陰離子交換柱層析填料是DEAE-52，DEAE Sepharose Fast Flow，洗脫劑可用水及不同濃度的鹽溶液、堿溶液和硼砂溶液等。

利用分子篩原理將分子量大小不同的組分進行分離的方法稱為凝膠過濾柱層析。在流動相的洗脫下，待分離的各組分按其分子由大到小的順序依次分離(分離原理如圖1 B所示)，常用的凝膠過濾填料有Sephadex，Sephacryl，Superdex系列填料。離子交換層析和凝膠過濾層析常聯(lián)合用于多糖純化。Feng SL等[36]用DEAE-52 cellulose 和Sephadex G-100柱層析，從三七根中分離到具有抗氧化活性MRP5 和MRP5A。柱色譜法所需設備簡單，操作方便，不需要有機溶劑，對多糖等高分子物質(zhì)具有很高的分離效率。但因上樣量小，流速慢，不耐壓，且填料價格昂貴，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用，目前大多局限于實驗室使用。

通過一種或數(shù)種分離純化方法的應用，可得到均一多糖組分。而均一多糖組分的獲得是結構解析的前提，因此要對多糖結構有清晰認識，還要借助于分離純化方法的發(fā)展及應用。

3 多糖的結構分析方法

結構不明確，藥效物質(zhì)基礎不清楚已成為多糖類新藥研發(fā)的關鍵問題和瓶頸問題。認識多糖結構有利于深入研究其生物活性，對多糖的基礎研究和應用具有重要意義。

多糖的結構較復雜，分為一級、二級、三級和四級結構，因而多糖結構解析存在很大的難度，特別是對二、三、四級結構的解析目前尚無有效手段，但當前對多糖一級結構解析技術已相對成熟(如圖2所示)。

3.1 多糖分子量測定 多糖屬于大分子物質(zhì)，獲取分子量大小及分布對認識多糖結構具有重要意義，常用檢測方法有：超速離心法，高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)、電泳法和旋光度測定法，質(zhì)譜法，光散射法。

HPGPC法測定多糖分子量的原理是：不同分子量多糖組分在凝膠柱上的保留時間不一致，常選用一系列已知分子量的標準物質(zhì)(常用葡聚糖[37])，建立分子量與保留時間的關系曲線，然后根據(jù)待測樣品在凝膠柱上的保留時間求得相對分子質(zhì)量及分子量分布范圍。該方法快速，分辨率高，重現(xiàn)性好，是目前測定多糖分子量的主要方法，但HPGPC法測定結果與所用標準品密切相關，若標準品與待測樣品的性質(zhì)，形狀等有較大的差別[38]，或所選凝膠柱，流動相不恰當，則會造成較大的誤差。

光散射法是應用多角度激光光散射儀(MALLS)測定多糖的絕對分子質(zhì)量，當激光照射到多糖樣品時，會在各個方向產(chǎn)生散射光，在任何方向的光散射強度與分子質(zhì)量和溶液的濃度成正比，散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關[39]，故而可通過相關參數(shù)的變化，求得待測樣品的分子質(zhì)量，該方法不需要標準品，結果的可靠性較高，但該方法要求待測樣品為單一組分，否則將無法得到準確的分子量信息。

綜合考慮上述兩種方法的優(yōu)缺點，凝膠滲透色譜(GPC)與多角度激光光散射聯(lián)用技術已成為當前較為理想的分子量測定方法，該方法不需要標準品校正，有較高的精度，而GPC又可將混合組分按一定順序洗脫出來，從而克服了光散射法不能測定混合物分子量的缺點，因此，GPC-MALLS越來越多的被用于多糖分子量測定。吳揚蘭等[40]研究發(fā)現(xiàn)，GPC-MALLS可較準確測定香菇多糖的分子量并對構型進行分析。

3.2 單糖組成分析 單糖組成分析是研究多糖結構的基礎，常以完全酸水解配合高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜法(GC)，離子色譜法(HPAEC)等進行分析。2 mol/L三氟乙酸可將多糖水解為單糖[41]，但水解后的單糖無紫外吸收，也不能氣化，必須經(jīng)過衍生化才能進行分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是應用最多的衍生化試劑，經(jīng)衍生化處理后，單糖在250 nm附近有較強紫外吸收，以C18柱，紫外檢測器即可對單糖組成進行分析[42]，該方法靈敏，重現(xiàn)性較好。

氣相色譜法靈敏度高，樣品用量少，若與質(zhì)譜法連用，則會大大地提高分析的準確度。但水解后的單糖極性大，難以氣化，因而必須經(jīng)過衍生，常將單糖衍生為糖腈乙酸酯衍生物[43]。

離子色譜法(HPAEC)是新發(fā)展的單糖組成分析方法，該方法不需要經(jīng)過復雜的衍生化處理就可以進行分析。其基本原理為：糖類化合物具有電化學活性，在強堿溶液中(pH>12)呈離子狀態(tài)，可以在陰離子交換柱上被保留從而被分離。常用0.01～0.2 mol/L NaOH，NaAC作梯度洗脫，以金電極的脈沖安倍檢測器檢測[44-45]。該方法非常靈敏，可檢測pmol/L的糖[46]。

3.3 多糖鍵合結構分析

3.3.1 糖環(huán)類型及構型分析 單糖在自然界中以吡喃環(huán)或呋喃環(huán)的形式存在，借助紅外光譜及核磁可分析單糖的成環(huán)類型。吡喃環(huán)在1010～1100 cm-1之間有三個吸收峰，而呋喃環(huán)只有兩個吸收峰[47]。同時可依據(jù)13C NMR數(shù)據(jù)確定糖環(huán)類型，呋喃環(huán)的C3和C5在δ82-84 ppm間有信號，吡喃環(huán)的C3和C5化學位移小于δ80 ppm[48]。單糖成環(huán)后會形成一個端基碳原子，有α和β兩種構象，α-端基差向異構的C-H變角振動在(844±4)cm-1，H-1質(zhì)子化學位移大于δ4.95 ppm；而β-端基差向異構的C-H變角振動在(891±7)cm-1[49]，H-1質(zhì)子化學位移小于δ4.95 ppm[50]。

3.3.2 糖殘基類型及糖苷鍵連接位點分析 糖殘基類型及糖苷鍵連接位點分析主要方法是甲基化反應與GC-MS法聯(lián)用。甲基化反應將單糖殘基中游離的羥基全部甲基化，然后將糖苷鍵水解，水解后羥基的位置，就是糖殘基的連接位點。多糖甲基化方法主要包括Haworth法[51]、Kuhn法[52]、Purdie法、Needs法[53]和改良Haworth法等。樣品甲基化完全后，完全水解為單糖，然后衍生化為部分甲基化糖醇乙酸酯，經(jīng)GC-MS分析，與標準譜圖進行比較，確定糖殘基類型及糖苷鍵連接位點。隨著NMR技術的發(fā)展，NMR也逐步引入到多糖結構研究中[54]。通過1H NMR異頭氫的信號確定糖殘基的數(shù)目。多糖由幾種糖殘基，則在1H NMR δ4.3-5.9 ppm就有幾個信號[55]。高碘酸氧化是用高碘酸為氧化劑的選擇性氧化降解反應，反應過程中每斷開一個C-C鍵消耗一份子高碘酸，通過測定高碘酸消耗量及甲酸生成量，可判斷糖苷鍵的位置和支鏈多糖的分支數(shù)目等。同時，結合Smith降解法綜合分析，有益于更好的獲得多糖的一級結構信息。但隨著GC-MS，2D NMR的發(fā)展，上述兩種方法已較少使用。

3.3.3 糖苷鍵連接順序分析 糖殘基的連接順序可以看作是高級結構的基礎?；诙嗵撬庖?guī)律(吡喃糖殘基比呋喃糖殘基穩(wěn)定解，己糖比戊糖穩(wěn)定，1,6-糖苷鍵對酸水解較穩(wěn)定，主鏈比支鏈穩(wěn)定)的糖苷酶順序水解法，選擇性酸水解法[56]可用于獲得主鏈、支鏈等小片段，再結合單糖組成、甲基化分析、1D NMR和2D NMR等方法共同用于糖殘基連接順序的研究。

4 展望

多糖的研究在近年來已取得較大突破，現(xiàn)代儀器分析技術與經(jīng)典的化學分析方法結合在多糖結構解析上取得了長足的進步。但仍然存在一系列棘手問題，首先，在多糖的分離純化方面，由于同一中藥可能含有數(shù)種或數(shù)十種多糖，各種多糖性質(zhì)相似，同時多糖分離純化方法的重現(xiàn)性較差，因而要得到均一活性多糖組分并不容易。其次，多糖結構解析仍難度較大，當前對多糖結構解析多停留在解析一級結構，對多糖高級結構信息知之甚少，從而限制了尋求更加穩(wěn)定，專屬性更強、效率更高的分離純化方法，更加制約了多糖構效關系及作用機制研究。在未來，多糖的研究將集中于尋找更加有效的結構解析方法，以此來推動高效率的分離純化方法的建立和加快多糖作用機制研究。