藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選壯藥柏金顆粒的水提醇沉工藝

張雅 王一喬 馬卓雅 梅之南 滕紅麗

摘 要 目的：優(yōu)選壯藥柏金顆粒的最佳水提醇沉工藝。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定柏金顆粒組方藥材中提取物中巖白菜素的含量。以浸膏得率結(jié)合小鼠降尿酸實(shí)驗(yàn)，初步篩選柏金顆粒的提取工藝路線（水煎煮、70%乙醇回流提取、水煎煮結(jié)合70%乙醇回流提取）。以浸膏得率和巖白菜素含量為指標(biāo)，首先采用正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等3個(gè)因素的影響，優(yōu)化柏金顆粒的最佳水提工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn);然后采用正交試驗(yàn)考察藥液相對(duì)密度、含醇量、醇沉?xí)r間等3個(gè)因素的影響，優(yōu)選柏金顆粒的最佳醇沉工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)小鼠降尿酸實(shí)驗(yàn)，比較醇沉處理前后柏金顆粒組方藥材提取物的效果差異。結(jié)果：所建立的巖白菜素含量測(cè)定方法的線性范圍為0.007 2～0.288 mg/mL，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均良好。柏金顆粒的提取工藝初步篩選為水煎煮提取;最佳水提工藝為加入14倍量（mL/g）水，浸泡0.5 h后，煎煮提取3次，每次1.0 h;最佳醇沉工藝為水提液濃縮至相對(duì)密度1.0 g/mL，藥液含醇量60%，醇沉?xí)r間12 h;驗(yàn)證試驗(yàn)均顯示，所得浸膏得率及其巖白菜素含量的RSD均小于2%（n=3）。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水提物（醇沉前）和水提醇沉物（醇沉后）均能顯著降低高尿酸血癥模型小鼠的尿酸水平（P<0.01），且兩者降尿酸效果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：采用優(yōu)化的水提工藝可獲得干浸膏得率和巖白菜素含量均較高的提取物，結(jié)合醇沉工藝除雜不影響其藥效。該優(yōu)化水提醇沉工藝可行，可用于柏金顆粒組方藥材的提取、除雜。

關(guān)鍵詞 壯藥;柏金顆粒;水提取;醇沉;正交試驗(yàn);藥效學(xué);巖白菜素;高尿酸血癥

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the water extraction and ethanol precipitation technology of Zhuang medicine Baijin granules. METHODS： HPLC method was adopted to determine the content of bergenin in Baijin granules extract. The extraction routes of Baijin granules （water decoction， 70% ethanol reflux extraction， water decoction combined with 70% ethanol reflux extraction） was screened primarily with the yield of extract and the experiment of reducing uric acid of mice. The orthogonal test was adopted to optimize water extraction technology of Baijin granules with water multiple，extraction time and extraction times as factors， taking the extraction yield and the bergenin content as index， then the validation test was carried out. The orthogonal test was adopted to optimize the alcohol precipitation process of Baijin granules including the relative density of medicinal materials，alcohol content and the alcohol precipitation time， then the validation test was carried out. By the experiment of reducing uric acid， the effects of medicinal materials extract of Baijin granules extract were compared before and after ethanol precipitation. RESLUTS： Established method for content determination of bergenin with linearity range? of 0.007 2-0.288 mg/mL， had good precision， reproducibility， stability and accuracy. The initially chosen extraction process of Baijin granules was water decoction extraction. The optimal water extraction technology was soaked for 0.5 h， then decocted for 3 times with 14-fold water （mL/g） and 1.0 h each time. The optimal ethanol precipitation process was to concentrate the water extract to a relative density of 1.0 g/mL with alcohol content of liquid at 60% and precipitated for 12 h. Validation tests showed that RSDs of extract yield and beragenin content were all lower than 2% （n=3）. The experiment of pharmacodynamics showed that water extract （before ethanol precipitation） and water extract after alcohol precipitation could significantly decrease the level of uric acid in hyperuricemia model mice （P<0.01）. There was no statistical significance in the reduction of uric acid between 2 groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： The optimized water extraction technology can obtain good extract yield and bergenin content， and combined with ethanol precipitation technology for removing excess impurities would not affect the pharmacodynamics. The water extraction and ethanol precipitation technology is feasible， and can be used for extracting the medicinal materials of? Baijin granules and its edulcoration.

KEYWORDS? ?Zhuang medicine; Baijin granules; Water extraction;Ethanol precipitation;Orthogonal test; Pharmacodynamics; Bergenin; Hyperuricemia

高尿酸血癥（Hyperuricemia）是一種以血尿酸升高為特征的代謝疾病，在臨床上表現(xiàn)為血尿酸水平高于正常范圍（男性為420 μmol/L，女性為350 μmol/L）的異常機(jī)體狀態(tài)[1]，也是導(dǎo)致高血壓、高血脂、冠心病等發(fā)生的重要原因之一[2-4]，對(duì)人類(lèi)健康的威脅日益加深。柏金方為廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由石上柏7.5 g、鐵包金5 g、小葉金花草5 g、土茯苓5 g、蘇木5 g、廣金錢(qián)草7.5 g、益母草7.5 g、白茅根15 g、葫蘆茶5 g、矮地茶5 g、木賊15 g、甘草2.5 g共12味藥材組成，經(jīng)該院多年臨床驗(yàn)證適用于高尿酸血癥的治療，療效顯著。本方以壯醫(yī)藥學(xué)理論為指導(dǎo)，通過(guò)主藥、幫藥、帶藥進(jìn)行組方，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、整體性調(diào)節(jié)機(jī)體的特點(diǎn)[5-6]。方中石上柏、鐵包金、小葉金花草等3味為主藥，合用可通龍路、調(diào)氣道、解熱毒;土茯苓、蘇木、廣金錢(qián)草、益母草、白茅根、葫蘆茶、矮地茶、木賊等8味為幫藥，有加強(qiáng)主藥清熱除濕祛風(fēng)之功效，通調(diào)三道兩路;再佐以甘草調(diào)和解毒，是為帶藥[5-7]。

柏金方原為煎煮湯劑，但湯劑存在煎煮過(guò)程繁瑣、不便于攜帶和保存、服用量大等缺點(diǎn)。為了解決這些問(wèn)題并提高患者用藥依從性，本課題組擬對(duì)柏金方進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，將其研制成顆粒劑。本研究以該方組方藥材提取物的浸膏得率和具有明確的抗高尿酸活性的巖白菜素（矮地茶主要活性成分[8]）的含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取正交設(shè)計(jì)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出柏金顆粒的最佳水提工藝，并采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出最佳醇沉工藝，再考察醇沉法除去雜質(zhì)的過(guò)程對(duì)其藥效作用的影響，最終確定柏金顆粒的最佳水提醇沉工藝，為后續(xù)該顆粒劑的進(jìn)一步研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;DGF-4AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱、98-1-B型電子控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）;KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JA2003N型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）;CP21型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司];1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];TGL-16A型醫(yī)用離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

白茅根、矮地茶、木賊等3味藥材飲片均購(gòu)自廣西仙茱中藥科技有限公司（批號(hào)分別為20180801、20171001、20181001）;石上柏、鐵包金、葫蘆茶、小葉金花草、土茯苓、廣金錢(qián)草、甘草、益母草、蘇木等9味藥材飲片均購(gòu)自廣西華夏藥源藥業(yè)有限公司（批號(hào)分別為190101、190101、190101、190101、180601、190101、181101、190101、190101）。以上藥材飲片經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋教授鑒定，均為真品。其中，葫蘆茶符合1977年版《中國(guó)藥典》（一部）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，石上柏、鐵包金符合2011年版《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第2卷）》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]，小葉金花草符合2018年版《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第3卷）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]，其余藥材均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]。

巖白菜素對(duì)照品（批號(hào)：Y24A8Y17096，純度：≥98%）、氧嗪酸鉀（批號(hào)：R10J8X39379，純度：>98%）、別嘌醇（陽(yáng)性對(duì)照，批號(hào)：Y27O8C46913，純度：>98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;尿酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181017）;酵母膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180328）;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純，批號(hào)：20140520）;0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1807110908，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 柏金顆粒組方藥材提取物中巖白菜素的含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[11]，采用HPLC法測(cè)定柏金顆粒干浸膏中巖白菜素的含量。

2.1.1 柏金顆粒干浸膏的制備 按柏金方處方比例，稱(chēng)取藥材飲片共200 g，按照相應(yīng)工藝提取后，在70 ℃條件下將提取液減壓濃縮至清膏;將上述清膏在80 ℃的條件下烘干成干浸膏，置于干燥器中冷卻1 h，稱(chēng)定質(zhì)量，研磨，過(guò)三號(hào)篩，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取巖白菜素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg巖白菜素的對(duì)照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)下所得柏金顆粒干浸膏粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理40 min，放冷，再次稱(chēng)定，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 缺矮地茶陰性樣品溶液的制備 根據(jù)處方比例稱(chēng)取除矮地茶外的其余藥材，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得陰性干浸膏粉末，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成缺矮地茶陰性樣品溶液。

2.1.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent Pursuit 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（15 ∶ 85，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：5 μL。取“2.1.2”～“2.1.4” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺矮地茶陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，各色譜峰分離良好，理論板數(shù)按巖白菜素峰計(jì)算不低于1 500，陰性樣品不干擾測(cè)定，表明方法適用性良好。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取巖白菜素對(duì)照品0.018 0 g，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.36 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取該對(duì)照品貯備液0.2、1、2、4、6、8 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以巖白菜素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=6.966x+3.685 8（r=0.999 9）。結(jié)果表明，巖白菜素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.007 2～0.288 mg/mL。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，巖白菜素峰面積的RSD為0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批柏金顆粒干浸膏粉末（編號(hào)：180101）約0.4 g，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算巖白菜素含量。結(jié)果，巖白菜素的平均含量為3.157 mg/g（RSD=1.43%，n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（編號(hào)：180101），分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，巖白菜素峰面積的RSD為1.87%（n=8），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知巖白菜素含量的干浸膏粉末（編號(hào)：180101）約0.1 g，共6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入“2.1.6”項(xiàng)下0.288 mg/mL的巖白菜素對(duì)照品溶液1.0 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，巖白菜素的平均加樣回收率為98.12%（RSD=2.08%，n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.11 干浸膏樣品的含量測(cè)定 精密稱(chēng)取柏金顆粒提取干浸膏樣品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算巖白菜素含量。每批樣品平行測(cè)定2次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。

2.2 柏金顆粒提取工藝路線的初步篩選

2.2.1 提取工藝路線的設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本方藥材提取中主要有水煎煮提取和乙醇回流提取方法[12-15]，本研究以此為基礎(chǔ)，初步篩選設(shè)計(jì)了3條工藝路線。（1）工藝Ⅰ：方中所有藥材混合后，加入14倍量（mL/g，下同）水煎煮提取2次，每次1 h，合并提取液。（2）工藝Ⅱ：方中所有藥材混合后，加入14倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液。（3）工藝Ⅲ：將石上柏、益母草混合后，加入14倍量水煎煮提取2次;其余藥材混合后，加入14倍量70%乙醇回流提取2次，每次均為1 h，合并提取液。

2.2.2 不同提取工藝浸膏得率的比較 根據(jù)處方比例稱(chēng)取全部藥材的混合物200 g，共9份，先用水浸泡0.5 h后，分別按“2.2.1”項(xiàng)下3種工藝路線提取，每種工藝平行3份。所得提取液在70 ℃下減壓濃縮成清膏后，轉(zhuǎn)移至已稱(chēng)定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在80 ℃下干燥至恒定質(zhì)量，再置于干燥器中冷卻1 h，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。結(jié)果，按平均浸膏得率高低排序依次為：工藝Ⅰ>工藝Ⅲ>工藝Ⅱ，即將所有藥材混合后加水提取獲得的浸膏得率最高，詳見(jiàn)表1。

2.2.3 不同提取工藝提取物的降尿酸作用比較 采用酵母膏灌胃聯(lián)合氧嗪酸鉀腹腔注射法建立高尿酸小鼠模型[16-18]。選取小鼠48只，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和工藝Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取物組（分別選用180101、180201、180301批樣品給藥），每組8只。各組小鼠均按體質(zhì)量灌胃或注射給藥。陰性對(duì)照組小鼠每天上午9點(diǎn)、下午3點(diǎn)（以下同）各灌胃1次相應(yīng)體積的水;模型組和各給藥組小鼠每天上午均灌胃酵母膏水溶液（10 g/kg），灌胃體積為20 mL/（kg·d）;模型組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每天下午灌胃水10 mL/（kg·d）;工藝Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取物組小鼠每天下午灌胃“2.2.2”項(xiàng)下3種不同工藝提取物水溶液[其中，180101批樣品劑量為3.762 g/kg（人日服生藥量為1.21 g/kg，以臨床2倍劑量換算成小鼠的灌胃生藥量為22 g/kg[19]，再以浸膏得率計(jì)算，即得，下同）;180201批樣品劑量為3.612 g/kg;180301批樣品劑量為3.711 g/kg]，灌胃體積均為10 mL/（kg·d）。各組小鼠連續(xù)灌胃7 d。于第8天時(shí)，小鼠提前禁食不禁水12 h，稱(chēng)定體質(zhì)量后，陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射0.8%CMC-Na溶液15 mL/kg，模型組和各給藥組小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀溶液（600 mg/kg，以0.8%CMC-Na溶液為溶劑）15 mL/kg。腹腔注射1 h后，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠一次性灌胃別嘌醇混懸液（0.005 g/kg[20]，以0.8%CMC-Na溶液為溶劑），工藝Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取物組小鼠則分別最后一次灌胃3種不同工藝提取物水溶液，灌胃體積均為10 mL/（kg·d）。末次給藥結(jié)束后1 h時(shí)，于小鼠眼眶靜脈叢采血，靜置1 h，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，按尿酸試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中尿酸水平。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理所得數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組相比，模型組小鼠血清尿酸水平顯著升高（P<0.01），表明高尿酸模型復(fù)制成功;與模型組比較，各給藥組小鼠血清尿酸水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），即3種工藝提取物對(duì)高尿酸模型小鼠均有顯著的降尿酸效果。

2.2.4 提取工藝初步篩選分析結(jié)果 結(jié)合“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下浸膏得率和小鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，工藝Ⅰ浸膏得率最高，3種工藝提取物對(duì)高尿酸模型小鼠均具有顯著的降尿酸效果。本課題組考慮到乙醇作為提取溶劑雖然沒(méi)有毒性，但是提取物中葉綠素含量較高，且后續(xù)純化工作復(fù)雜[13]，再結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，因此選擇工藝Ⅰ作為本研究的提取工藝，即所有藥材混合后以水進(jìn)行煎煮提取。

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選柏金顆粒的水提工藝

2.3.1 正交設(shè)計(jì)與試驗(yàn) 在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，以浸膏得率、巖白菜素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)[21-22]，以加水倍量（A，mL/g）、提取時(shí)間（B，h）、提取次數(shù)（C，次）為因素，按處方比例稱(chēng)取9份藥材混合物，每份200 g，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。水提工藝因素與水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

由表4、表5可見(jiàn)，以浸膏得率為考察指標(biāo)，各因素影響作用大小排序?yàn)镃>A>B，其中因素C對(duì)浸膏得率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因素A、B的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;以巖白菜素含量為考察指標(biāo)，各因素影響作用大小排序?yàn)镃>B>A，但這3個(gè)因素對(duì)巖白菜素含量的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜合考慮后，優(yōu)選出最佳工藝為A2B1C3，即加入14倍量的水，煎煮提取3次，每次1.0 h。

2.3.2 水提工藝驗(yàn)證 按照處方比例，稱(chēng)取藥材混合物100 g，按照“2.3.1”項(xiàng)下優(yōu)選的最佳水提工藝加水浸泡0.5 h后，煎煮提取，合并提取液，旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)濃縮至清膏后轉(zhuǎn)入已稱(chēng)定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在80 ℃下烘干成干浸膏，置于干燥器中冷卻1 h，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率，并按“2.1.11”項(xiàng)下方法評(píng)定巖白菜素含量。平行操作3次。結(jié)果，平均浸膏得率為20.48%（RSD=1.53%，n=3），平均巖白菜素含量為3.144 mg/g（RSD=1.26%，n=3），表明優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 柏金顆粒的醇沉工藝優(yōu)化

2.4.1 醇沉提取物的制備 按處方比例稱(chēng)取各藥材飲片，按照“2.3”項(xiàng)下優(yōu)選的最佳水提工藝進(jìn)行提取，濃縮至一定密度，再根據(jù)一定工藝進(jìn)行醇沉，抽濾，將濾液減壓濃縮至清膏后轉(zhuǎn)入已稱(chēng)定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在80 ℃下烘干成干浸膏，置于干燥器中冷卻1 h，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率，研磨，過(guò)三號(hào)篩，備用。

2.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化醇沉工藝 在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，以浸膏得率、巖白菜素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選定藥液相對(duì)密度[A，g/mL（以生藥量計(jì)）]、含醇量（B，%）、醇沉?xí)r間（C，h）為考察因素[21-22]，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)。醇沉工藝因素與水平見(jiàn)表6，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

由表7、表8可見(jiàn)，以浸膏得率為考察指標(biāo)，各因素影響作用大小排序?yàn)锽>A>C，但這3個(gè)因素對(duì)醇沉效果的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;以巖白菜素含量為考察指標(biāo)，各因素影響作用大小排序?yàn)镃>A>B，其中因素C對(duì)醇沉效果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而因素A、B的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜合考慮，優(yōu)選出最佳醇沉工藝為A2B1C1，即水提液濃縮至相對(duì)密度為1.0 g/mL，藥液含醇量為60%，醇沉?xí)r間為12 h。

2.4.3 醇沉工藝驗(yàn)證 按照處方比例，稱(chēng)取藥材混合物100 g，按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)選的最佳水提工藝進(jìn)行提取后，再按“2.4.2”優(yōu)選的最佳醇沉工藝進(jìn)行醇沉處理后，抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)濃縮至清膏后轉(zhuǎn)入已稱(chēng)定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在80 ℃下烘干成干浸膏，置于干燥器中冷卻1 h，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率并按“2.1.11”項(xiàng)下方法測(cè)定巖白菜素含量。平行操作3次。結(jié)果，平均浸膏得率為11.01%（RSD=1.77%，n=3），平均巖白菜素含量為3.634 mg/g（RSD=1.60%，n=3），表明優(yōu)選的醇沉工藝穩(wěn)定、可行。

2.5 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)比較柏金顆粒提取工藝醇沉處理前后的差異

取小鼠40只，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、水提物組、水提醇沉物組，每組8只。按照“2.2.3”下方法進(jìn)行造模和給藥。其中，水提物組灌胃劑量為4.52 g/kg，水提醇沉物組大鼠灌胃劑量為2.39 g/kg（均以提取物計(jì)算，按不同工藝得率換算后相當(dāng)于等量生藥材），灌胃體積均為10 mL/（kg·d）。同法測(cè)定大鼠血清中尿酸水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9可知，與陰性對(duì)照組比較，模型組小鼠血清尿酸水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠血清尿酸水平均顯著降低（P<0.01），且水提物組與水提醇沉物組小鼠尿酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），即醇沉處理后提取物藥效并未受到影響，因此選擇水提醇沉法作為本方的最佳提取工藝。

3 討論

3.1 藥效學(xué)模型的建立

本研究在前期藥效學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)中嘗試過(guò)不同造模劑誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型[23-24]：腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇、次黃嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀、酵母膏聯(lián)合氧嗪酸鉀;也比較過(guò)誘導(dǎo)7 d和誘導(dǎo)14 d對(duì)小鼠尿酸水平的影響。經(jīng)過(guò)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，酵母膏聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)7 d可復(fù)制出較為穩(wěn)定的高尿酸小鼠模型，且對(duì)小鼠腎功能影響較小，因此本研究最終選擇酵母膏灌胃聯(lián)合氧嗪酸鉀腹腔注射的造模方法。

3.2 工藝優(yōu)化中評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

柏金方中含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、香豆素類(lèi)等多種類(lèi)型化學(xué)成分[25-27]，但是有關(guān)其治療高尿酸血癥的有效成分研究較少。根據(jù)文獻(xiàn)記載，目前比較明確的是矮地茶中的巖白菜素和土茯苓中的落新婦苷為降尿酸的主要有效成分[7]，二者對(duì)黃嘌呤氧化酶均有抑制活性，能促進(jìn)腎臟尿酸排泄、改善腎功能，而黃嘌呤氧化酶是尿酸生成的關(guān)鍵酶[8，28]。然而前期研究發(fā)現(xiàn)，本方中含有落新婦苷、夏佛塔苷、芹菜素、槲皮素等大量黃酮類(lèi)成分，彼此干擾很大，較難建立專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的HPLC分析檢測(cè)方法。因此，本課題最終選取巖白菜素作為矮地茶藥材的含量測(cè)定指標(biāo)。此外，干浸膏是復(fù)方制劑中發(fā)揮臨床作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，浸膏得率的高低可在很大程度上反映出制劑工藝的優(yōu)劣。因此，本研究最終選擇浸膏得率和巖白菜素含量作為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.3 制劑工藝的篩選及優(yōu)化

本研究在預(yù)試驗(yàn)中對(duì)預(yù)浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了單因素考察，發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間對(duì)浸膏得率并無(wú)影響，因此并未將其納入正交設(shè)計(jì)的因素篩選范圍，而是按照中藥材常規(guī)提取流程進(jìn)行預(yù)浸泡0.5 h。本研究選取藥效學(xué)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合浸膏得率和巖白菜素含量進(jìn)行提取工藝的初步篩選，確定全方采用水提工藝后，再通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳的水提工藝。由于水提物中含有鞣質(zhì)、淀粉等大量雜質(zhì)，為了富集有效成分、降低出膏率，減少患者每日服用量，本課題組考慮在不影響藥效的情況下，采取醇沉法除去多余雜質(zhì)，在借助正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳醇沉工藝的基礎(chǔ)上，采用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)比較醇沉前后提取物的降尿酸作用。結(jié)果顯示，醇沉工藝對(duì)其降尿酸藥效作用無(wú)顯著影響。綜上，優(yōu)化的水提醇沉工藝可用于柏金顆粒組方藥材的提取、除雜。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] JOHNSON RJ，BAKRIS GL，BORGHI C，et al. Hyperuricemia，acute and chronic kidney disease，hypertension，and cardiovascular disease：report of a scientific workshop organized by the national kidney foundation[J]. Am J Kidney Dis，2018，71（6）：851-865.

[ 2 ] 郭珺，羅文浩，鮮文.高血尿酸水平與高脂血癥的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2019，47（7）：801-804.

[ 3 ] 馮志航，黃石安.高尿酸血癥與冠狀動(dòng)脈病變的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué)，2019，30（14）：1865-1868.

[ 4 ] 尹非，李雪晨，葉菲.高尿酸血癥與代謝綜合征研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2017，44（6）：487-499.

[ 5 ] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第2卷[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2011：79、234.

[ 6 ] 韋松基.實(shí)用壯藥學(xué)[M].北京：北京大學(xué)出版社，2017：16.

[ 7 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：18、44-45、63、86-87、109、164、290-291、361.

[ 8 ] 周宏星，陳玉勝.巖白菜素抗高尿酸血癥的活性及機(jī)制研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（1）：63-67.

[ 9 ] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 1977年版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：570.

[10] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第3卷[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2018：61-62.

[11] 何柯，張榮，晁若冰.熊膽川貝枇杷膏中藥材的薄層色譜鑒別和?；切苋パ跄懰峒皫r白菜素的測(cè)定[J].華西藥學(xué)雜志，2016，31（6）：650-653.

[12] 羅蘭，張素中，黃月純，等.廣金草總黃酮成分不同提取方法的比較[J].中成藥，2015，37（11）：2537-2540.

[13] 趙之麗，趙平，鄧光銳，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方江南卷柏散提取工藝[J].中國(guó)藥房，2016，27（28）：3996-3998.

[14] 易飛.木賊總黃酮的提取及活性研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

[15] 閆曼，安雅婷，李艦，等.益母草提取物對(duì)大鼠高尿酸血癥的調(diào)控作用[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（24）：4856-4859.

[16] 迪麗達(dá)爾·希力甫，趙平，宋麗娟，等.酵母膏聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型大鼠繼發(fā)的心血管病變[J].中國(guó)組織工程研究，2012，16（11）：1994-1998.

[17] 張嫻嫻，孫維峰，徐偉，等.泄?jié)岢苑綄?duì)高尿酸血癥小鼠尿酸及URAT1的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：144-147.

[18] 王晗，張敏，路騰飛，等.高尿酸血癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（4）：253-256.

[19] 魏偉，吳希美，李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1698.

[20] 黃夢(mèng)玲.知黃痛風(fēng)湯的指紋圖譜及對(duì)痛風(fēng)的藥效學(xué)研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[21] 王敏，杜守穎，田志浩，等.藥效學(xué)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選參連顆粒的水提工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（8）：27-31.

[22] 杜正彩，齊彪，張明哲，等.正交設(shè)計(jì)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選桂梔助眠膠囊提取工藝研究[J].中草藥，2019，50（3）：618-625.

[23] 何宏明，馮育林，張武崗，等.不同方法建立高尿酸血癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2015（12）：72-75.

[24] 盧忠英，郁建平，朱夢(mèng)琪，等.不同組合造模劑誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型的比較研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2014，33（5）：40-42.

[25] 宋蕊，劉麗芳，馬海燕，等.江南卷柏的化學(xué)成分[J].藥學(xué)與臨床研究，2016，24（4）：318-320.

[26] 鐘鳴，柴玲.廣金錢(qián)草化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)學(xué)，2018，40（1）：80-82.

[27] 荊英珊，謝國(guó)勇，顧衛(wèi)衛(wèi)，等.鐵包金的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2017，36（1）：49-53.

[28] 王建平，張海燕，傅旭春.土茯苓的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2013，25（1）：42-44.

（收稿日期：2019-11-04 修回日期：2020-03-13）

（編輯：段思怡）