大豆多肽亞鐵螯合物的螯合條件優(yōu)化

摘要：以大豆（Glycine max）豆粕水解多肽為原料，硫酸亞鐵為鐵源，比較不同的抗氧化劑對(duì)于亞鐵離子在溶液中氧化的抑制效果，選擇最佳比例的抗氧化劑，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化大豆多肽亞鐵螯合物的螯合工藝條件，采用元素分析和紅外光譜對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行表征。結(jié)果表明，在抗氧化劑為抗壞血酸，抗壞血酸與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.150∶1，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為1∶1，pH 4，反應(yīng)時(shí)間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃的條件下，鐵螯合率為86.60%，螯合物得率可達(dá)46.49%。

關(guān)鍵詞：大豆（Glycine max）多肽；亞鐵螯合物；抗氧化劑；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S565.1；TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2197-04

鐵是生物體必需的微量元素，鐵元素的缺乏會(huì)產(chǎn)生多種疾病。補(bǔ)鐵劑包括無機(jī)鐵有機(jī)鐵、氨基酸鐵和生物鐵。普通的無機(jī)鐵和有機(jī)鐵吸收率低，且口感較差，補(bǔ)鐵劑的發(fā)展趨勢是氨基酸和肽的金屬螯合鹽，研究表明，氨基酸螯合鐵在動(dòng)物體內(nèi)的利用率是同水平硫酸亞鐵的近2倍[1]。目前，已有一些關(guān)于氨基酸及多肽鐵螯合物的報(bào)道，如鷹嘴豆蛋白肽鐵螯合物[2]、米蛋白多肽鐵螯合物[3]、魚和魚皮蛋白肽鐵螯合物[4，5]、β淀粉多肽鐵螯合物[6]，而關(guān)于大豆（Glycine max）豆粕水解多肽亞鐵螯合物的報(bào)道卻較少。

大豆豆粕水解多肽的原料是去皮大豆粕，經(jīng)過發(fā)酵、酶解、分離等過程制得，由幾十個(gè)氨基酸組成[7]。

由于亞鐵離子在水中容易被氧化，本試驗(yàn)研究了不同抗氧化劑對(duì)于螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)作用，同時(shí)考慮作為飼料添加劑不可有毒副作用，又有好的生物相容性，從而確定出最佳的抗氧化劑。本試驗(yàn)以大豆豆粕水解多肽和硫酸亞鐵為原料，加入抗氧化劑來抑制亞鐵離子的氧化，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化大豆多肽亞鐵螯合物的合成工藝，用紅外光譜法對(duì)螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，以期為開發(fā)新型補(bǔ)鐵類的飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆豆粕水解多肽（肽黃金粉末），湖北邦之德牧業(yè)科技有限公司；抗壞血酸（AR），上海伯奧生物科技有限公司；七水合硫酸亞鐵、鄰菲羅啉、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

雙光束紫外可見分光光度計(jì)[UV-4802型，尤尼柯（上海）儀器有限公司]；超純水機(jī)（UPT-Ⅱ-5T型，成都超純科技有限公司）；離心機(jī)（800-1型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；數(shù)字酸度計(jì)（PHS-25A型，上海大普儀器有限公司）；電子天平[AL104型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；元素分析儀（Vario EL Ⅲ型，德國元素分析系統(tǒng)公司）；恒溫磁力攪拌器（85-2型，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；紅外儀（NICOLET-iS10型，美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆多肽亞鐵螯合物的合成 采用水體系合成法合成氨基酸微量元素螯合物，基本工藝流程如圖1所示。在多肽提取液中，加入大豆多肽與鐵鹽的質(zhì)量比為3∶1的硫酸亞鐵，加入適量的抗壞血酸，用10%的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH，于室溫下混合反應(yīng)30 min，將離心后的上清液用無水乙醇處理得到沉淀，并用適量的甲醇洗滌，最后干燥得到大豆多肽亞鐵螯合物。

1.2.2 測定方法 用硫酸亞鐵銨Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O配制鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，在常溫下反應(yīng)60 min，以不加鐵離子的溶液作空白參比，在510 nm處測定吸光度。以鐵的濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8，9]，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.203 7C-0.000 7。

稱取大豆多肽亞鐵螯合物0.05 g，配制成0.1%大豆多肽亞鐵螯合物溶液。稱取1 mL樣品溶液于50 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測定其吸光度。

鐵離子含量（mg/kg）=■

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣品溶液對(duì)應(yīng)的鐵含量（mg）；m為樣品的質(zhì)量（kg）；V1為測定時(shí)樣品試液的體積（mL）；V0為樣品處理后的體積（mL）。

鐵螯合率的測定：

鐵螯合率=■×100%

式中，m1為螯合物中鐵的質(zhì)量（mg）；m0為加入反應(yīng)體系中鐵的總質(zhì)量（mg）。

大豆多肽亞鐵螯合物得率的測定：

螯合物得率=■×100%

式中，W1為大豆多肽亞鐵螯合物的總質(zhì)量（mg）；W0為多肽與鐵鹽的總質(zhì)量（mg）。

1.2.3 不同抗氧化劑對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)效果 二價(jià)鐵在水中極易被氧化為Fe2O3沉淀，需加入抗氧化劑加以保護(hù)，使大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)順利進(jìn)行。選擇亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、抗壞血酸、異抗壞血酸鈉進(jìn)行抗氧化對(duì)比試驗(yàn)。在燒杯中加入1.104 9 g多肽、1.104 9 g硫酸亞鐵鹽，再加入等量（各0.165 8 g）的上述4種抗氧化劑，調(diào)節(jié)至pH 4，室溫下螯合反應(yīng)30 min。然后將螯合反應(yīng)液離心，吸取上清液，將離心管中的沉淀干燥，比較沉淀的質(zhì)量。

選擇對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)中亞鐵離子保護(hù)效果最好的抗氧化劑，采用上述相同方法比較該抗氧化劑與硫酸亞鐵的不同質(zhì)量比（0.025∶1、0.050：1、0.100∶1、0.150∶1、0.200∶1）對(duì)螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)效果。3次重復(fù)，取算術(shù)平均值。

1.2.4 大豆多肽亞鐵螯合物的制備工藝 單因素試驗(yàn)：①pH。分析不同pH（3、4、5、6、7）對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響；②多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比。分析不同多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響；③反應(yīng)時(shí)間。分析不同反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響；④反應(yīng)溫度。分析不同反應(yīng)溫度（20、30、40、50、60 ℃）對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響。在各試驗(yàn)條件下，分析大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)中鐵螯合率和螯合物得率的變化。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH、多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為試驗(yàn)因素，以鐵螯合率和螯合物得率為測試指標(biāo)，每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取算術(shù)平均值，通過正交試驗(yàn)篩選出大豆多肽亞鐵螯合物制備的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.2.5 大豆多肽和大豆多肽亞鐵螯合物元素和紅外光譜分析 大豆多肽和大豆多肽亞鐵螯合物中的C、H、N采用元素分析儀（Vario EL Ⅲ型）測定[7]，二者的紅外光譜采用紅外儀（NICOLET-iS10型）測定[7，9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)效果

分析4種抗氧化劑對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)效果，亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、抗壞血酸、異抗壞血酸鈉處理的大豆多肽亞鐵螯合物沉淀的質(zhì)量分別為0.032 0、0.055 3、0.017 6、0.040 0 g。其中，抗壞血酸的抗氧化效果最好，因此，選擇抗壞血酸作為抗氧化劑。從圖1可以看出，當(dāng)抗壞血酸與硫酸亞鐵的質(zhì)量比為0.150∶1時(shí)，沉淀的質(zhì)量下降到最低點(diǎn)，且保持在較低的水平，所以選擇抗壞血酸的用量為硫酸亞鐵質(zhì)量的0.150倍。

2.2 大豆多肽亞鐵螯合物的制備工藝

2.2.1 pH對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 pH是影響多肽微量元素螯合物形成的重要因素，在pH較低的酸性環(huán)境中，氫離子與金屬離子競相爭奪供電子基團(tuán)，不利于多肽微量元素螯合物的形成。在pH較高的堿性環(huán)境中，羥基與供電子基團(tuán)爭奪金屬離子而形成氫氧化物沉淀。從圖2可以看出，pH對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)螯合率的影響比較大，在pH較低的條件下鐵螯合率較高，而螯合物得率受pH的影響比較小，綜合考慮大豆多肽亞鐵螯合物得率和鐵螯合率，可知最適合的pH為4。

2.2.2 多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 從圖3可以看出，大豆多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響比較大，在其質(zhì)量比為1∶1時(shí)，大豆多肽亞鐵螯合物得率和鐵螯合率都比較大，所以最適合的大豆多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為1∶1。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 由圖4可知，反應(yīng)時(shí)間在20～60 min時(shí)，大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)鐵螯合率都比較高，螯合物得率變化很小。由于反應(yīng)時(shí)間越長成本越高，綜合考慮螯合反應(yīng)完全和工業(yè)生產(chǎn)的成本，故選擇30 min為最佳的反應(yīng)時(shí)間。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 從圖5可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)螯合物得率和鐵螯合率均較高，故最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。

2.3 大豆多肽亞鐵螯合物合成工藝條件的優(yōu)化

通過對(duì)鐵螯合率的極差分析結(jié)果（表2）可以看出，影響大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)鐵螯合率的4個(gè)因素主次順序?yàn)锳、C、D、B，最優(yōu)組合為A2B2C3D2。通過螯合物得率的極差分析結(jié)果可以看出，影響螯合物得率的因素主次順序?yàn)锽、A、D、C，最優(yōu)組合為A2B1C2D1。

綜合2個(gè)指標(biāo)來看，相對(duì)于因素A取最優(yōu)組合對(duì)應(yīng)的水平為宜；對(duì)于因素B、C和D來說，由于在反應(yīng)中影響較小，基于成本考慮，選用B1、C2和D1為宜。最后得到的最佳工藝條件為多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比是1∶1，pH 4，反應(yīng)時(shí)間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得的鐵螯合率為86.60%，螯合物得率為46.49%，均高于其他正交試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 大豆多肽和大豆多肽亞鐵螯合物的元素和紅外光譜分析結(jié)果

2.4.1 大豆多肽和大豆多肽亞鐵螯合物元素分析 由表3可以看出，大豆豆粕水解多肽含鐵量為0，經(jīng)與硫酸亞鐵螯合后含鐵量為13.333%，N、C、H含量明顯降低，證明了大豆多肽亞鐵螯合物的生成。

2.4.2 大豆多肽和大豆多肽亞鐵螯合物紅外光譜分析 從圖6和圖7的對(duì)比可以看出，大豆多肽與其亞鐵鰲合物的吸收峰相比，在強(qiáng)弱和位置上有明顯的變化。大豆多肽的紅外光譜在2 600～3 100 cm-1有強(qiáng)寬譜帶，這是NH3+的特征吸收峰，而大豆多肽亞鐵螯合物的紅外光譜中無此吸收峰，說明大豆多肽亞鐵螯合物中沒有游離的NH3+。大豆多肽亞鐵螯合物在1 125 cm-1處出現(xiàn)了（Pt NH2）（Pt 指-NH2的面內(nèi)搖擺振動(dòng)）強(qiáng)吸收峰，在616 cm-1處出現(xiàn)了（Pr NH2） （Pr 指-NH2的面外搖擺振動(dòng)）的特征吸收峰，證明Fe2+與-NH2有較強(qiáng)結(jié)合性，與曹銀娣[10]報(bào)道結(jié)果一致。羧基離子的反對(duì)稱振動(dòng)在1 660 cm-1附近，羧基離子的對(duì)稱振動(dòng)在1 400 cm-1附近，這兩處吸收峰在鰲合前后均出現(xiàn)強(qiáng)弱變化，羧基也以共價(jià)鍵的方式與亞鐵離子結(jié)合。

3 小結(jié)

本研究對(duì)大豆多肽亞鐵螯合物的合成工藝條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了合成條件，即抗壞血酸與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.150∶1，大豆多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為1∶1，pH 4，反應(yīng)時(shí)間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃，在此條件下鐵，大豆多肽亞鐵螯合反應(yīng)鐵螯合率為86.60%，螯合物得率可達(dá)46.49%。元素分析及紅外光譜分析對(duì)大豆多肽和其亞鐵螯合物進(jìn)行表征，說明了亞鐵離子與氨基以及羧基以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，合成出新型的大豆多肽亞鐵螯合物。

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