響應(yīng)面法優(yōu)化廣棗總黃酮的超聲提取工藝研究

摘要：采用響應(yīng)面法超聲提取廣棗[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]中總黃酮，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0、5.0軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，研究乙醇溶液體積分數(shù)、液料比、超聲時間和超聲溫度對總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，廣棗中總黃酮的最佳超聲提取工藝參數(shù)乙醇溶液體積分數(shù)為62%，超聲提取時間為55 min，液料比為35.00∶1（V∶m），在此試驗條件下廣棗總黃酮平均提取率為3.472%。

關(guān)鍵詞：廣棗[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]；總黃酮；超聲提??；響應(yīng)面法

中圖分類號：S665.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2210-04

廣棗為漆樹科植物南酸棗[Choerospondias axillaris （Roxb.） Burtt et Hill]的干燥成熟果實，又名五眼果、酸棗、山棗子等，是蒙古族常用藥材[1]。廣棗性味甘、酸，具有行氣活血、養(yǎng)心安神的功能，用于氣滯血瘀、胸痹作痛、心悸氣短、心神不安等病癥的治療。廣棗中的化學(xué)成分包括黃酮、有機酸、甾醇、香豆素、揮發(fā)油、酚酸類、多糖、氨基酸及多種無機元素等[2]。廣棗中的總黃酮是其有效成分，具有多種生理活性作用。目前，廣棗中黃酮類化合物的提取方法主要有醇提熱回流法[3-5]、醇提滲漉法[6]及水煮提取法[7]等，且大多采用正交設(shè)計法研究其提取工藝。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面分析法[8，9]優(yōu)化廣棗中總黃酮的提取工藝，旨在為廣棗的進一步研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

廣棗藥材（毫州市中藥飲片廠，批號130426），經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室程齊來教授鑒定。蘆丁標準品（A0103，含量≥98%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

PE Lambda 35 UV/VIS型紫外可見分光光度計（美國珀金埃爾默公司）；FW135型手提中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；JT2002型分析天平（上海精天電子儀器公司）；EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械）；EYELA A-1000S型水式真空泵（上海愛明儀器有限公司）；202A-2型電熱干燥箱（上海陽光試驗儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精確稱取11.15 mg蘆丁標準品，用60%乙醇溶液溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得到111.5 mg/L的蘆丁標準溶液。精確量取蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10.0 mL容量瓶中。依次分別加入60%乙醇溶液稀釋至5.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，迅速搖勻，靜置6 min，最后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，充分搖勻。放置15 min后，以不加蘆丁的試劑作空白對照，測定波長為509 nm時的吸光度，得到吸光度（Y）與蘆丁溶液濃度（X）的回歸方程為Y=0.011 3X-0.001 7，R2=0.999 7。

1.2.2 廣棗總黃酮的超聲提取 將廣棗50 ℃恒溫烘干后粉碎過40目篩，稱取0.5 g，加入60%乙醇溶液15 mL，浸泡15 min后，在70 ℃下超聲50 min，抽濾。待樣品冷卻到室溫后再重復(fù)處理1次。合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，濃縮后用60%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中備用。

1.2.3 總黃酮含量的測定 吸取1 mL濾液于10 mL容量瓶中，按標準曲線的測定方法測定其吸光度，計算總黃酮含量和提取率。

1.2.4 單因素試驗 ①乙醇溶液體積分數(shù)。分析不同乙醇體積分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）對廣棗總黃酮提取率的影響；②液料比。分析不同液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL∶g）對廣棗總黃酮提取率的影響；③超聲時間。分析不同超聲時間（20、30、40、50、60、70 min）對廣棗總黃酮提取率的影響；④超聲溫度。分析不同超聲溫度（40、45、50、60、70 ℃）對廣棗總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取乙醇溶液體積分數(shù)（A）、超聲時間（B）、料液比（C）3個對總黃酮提取率影響較大的因素，對提取工藝條件進行響應(yīng)面分析，試驗因素及水平見表1。

1.2.6 驗證試驗 對Box-Behnken中心組合試驗優(yōu)化后的廣棗總黃酮提取工藝進行驗證試驗，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇溶液體積分數(shù)對廣棗總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著乙醇溶液體積分數(shù)的增大，廣棗總黃酮提取率先逐漸增大，當乙醇溶液體積分數(shù)為60%時，其提取率達到最大，之后提取率反而下降，故取乙醇溶液體積分數(shù)60%為宜。

2.1.2 液料比對廣棗總黃酮提取率的影響 由圖 2 可知，當液料比達到30∶1時，廣棗總黃酮基本溶出，繼續(xù)加大溶劑量，總黃酮提取率增長比較緩慢，故選擇液料比為30∶1為宜。

2.1.3 超聲時間對廣棗總黃酮提取率的影響 由圖3可知，在超聲時間20～50 min，廣棗總黃酮提取率隨著超聲時間的延長而增加，50 min以后，總黃酮提取率變化不大，可能是由于超聲時間的延長會破壞部分黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，致使提取率變化不大。綜合考慮，超聲時間為50 min為宜。

2.1.4 超聲溫度對廣棗總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲溫度的增加，廣棗總黃酮提取率呈上升趨勢，70 ℃時總黃酮提取率達到最高；考慮到乙醇的沸點，溫度過高時，溶劑會揮發(fā)，影響總黃酮的提取率，且試驗儀器溫度不能超過80 ℃，因此，選擇超聲提取溫度為70 ℃。

2.2 廣棗總黃酮提取工藝回歸模型的建立及方差分析

應(yīng)用 Design-Expert 8.0、5.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，得到了方差分析結(jié)果（表3）和響應(yīng)曲面圖（圖5）。

通過多元回歸擬合分析得到黃酮類化合物提取率（Y）與乙醇溶液體積分數(shù)（A）、超聲時間（B）和液料比（C）之間的二次多項回歸方程：Y=-2.795+0.162 5×A+0.130 5×B-0.200 5×C+（3.25E-003）×A×B+（1.85E-003）×A×C+（2.1E-003）×B×C-（3.313E-003）×A2-（3.65E-003）×B2+（5.5E-004）×C2。

由表3可以看出，回歸方程的P<0.01，說明本試驗所選用的二次多項模型極顯著。模型的確定系數(shù)達到0.985 0，說明該模型能解釋98.50%響應(yīng)值的變化。失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合良好，試驗誤差小。一次項中乙醇溶液體積分數(shù)、超聲時間及液料比對總黃酮提取率的線性效應(yīng)為極顯著；二次項中乙醇溶液體積分數(shù)對總黃酮提取率的曲面效應(yīng)極顯著，超聲時間對總黃酮提取率的曲面效應(yīng)顯著；比較各因素間，乙醇溶液體積分數(shù)和液料比之間交互作用顯著，乙醇溶液體積分數(shù)和超聲時間之間交互作用極顯著，超聲時間和液料比之間交互作用不顯著。根據(jù)Design-Expert 8.0、5.0軟件對試驗結(jié)果進行最優(yōu)化分析，確定最佳工藝參數(shù)為乙醇溶液體積分數(shù)為61.29%，超聲時間為55 min，液料比為35.00∶1，在此條件下預(yù)測總黃酮提取率為3.480%。

2.3 驗證試驗

考慮到實際操作的便利性，將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇溶液體積分數(shù)62%，超聲時間55 min，液料比35.00∶1，為了驗證模型的可靠性和穩(wěn)定性，在此試驗條件下進行分析，廣棗總黃酮平均提取率為3.472%（n=3）。

3 小結(jié)與討論

用超聲法提取廣棗中總黃酮，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對提取工藝進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇溶液體積分數(shù)62%，超聲時間55 min，液料比35.00∶1，在此工藝條件下，廣棗總黃酮提取率為3.472%（n=3）。本方法與傳統(tǒng)回流方法相比，不僅可以節(jié)省時間，還可提高提取率，是一種理想的提取廣棗總黃酮的方法。

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