石仙桃中總黃酮的提取及含量測定

摘要：采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用乙醇溶劑浸提結(jié)合微波輔助提取法對(duì)石仙桃（Phoidotaof chinensis Lind L.）總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用分光光度計(jì)比色法測定提取的總黃酮含量。結(jié)果表明，石仙桃總黃酮提取的最佳工藝條件為微波功率300 W，提取時(shí)間30 min，溫度60 ℃，料液比（m∶V，g∶mL）1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。按照最佳工藝條件進(jìn)行提取，石仙桃總黃酮提取量達(dá)31.41 mg/g。

關(guān)鍵詞：石仙桃（Phoidotaof chinensis Lind L.）；總黃酮；提取工藝；含量測定；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q949.71+8.43；O657.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2157-03

石仙桃系蘭科石仙桃屬植物石仙桃（Phoidotaof chinensis Lindl.）的全草，俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等，始載于《生草藥性備要》。其性甘味涼，具有養(yǎng)陰、清熱、利濕消瘀的功效，民間常用來治療高血壓病、頭暈和各種原因引起的頭痛[1]。石仙桃屬植物全球約30種，中國有14種，產(chǎn)于南方，尤以西南地區(qū)多見[2]。研究[3]表明，石仙桃主要化學(xué)成分為萜類、酚類、木脂素類、黃酮類，多糖等。目前石仙桃化學(xué)成分的定量研究主要是對(duì)揮發(fā)油等的研究[4，5]，目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)石仙桃總黃酮提取工藝的研究。為此采用微波提取法提取石仙桃總黃酮，以石仙桃總黃酮提取量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探究微波法提取石仙桃總黃酮的最佳工藝，旨在為石仙桃進(jìn)一步研究和資源開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石仙桃全草采自贛南；蘆丁對(duì)照品由北京恒元啟天化工技術(shù)研究院提供。

WF-4000C型常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；λ-35型紫外可見分光光度計(jì)（美國鉑金埃爾默公司）；DZF-6050型烘箱（上海一恒科技有限公司）；ABl35-S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取蘆丁對(duì)照品2.70 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解，10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞試管中，加水至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻放置6 min，加10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻放置6 min，加4%氫氧化鈉3.0 mL，搖勻， 加水至刻度，搖勻放置15 min。另取一10 mL具塞試管，不加對(duì)照品溶液，只加顯色劑，按照上法制成空白對(duì)照。采用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=12.971 C-0.0076，r=0.999 6，A表示吸光度，C表示蘆丁溶液濃度。蘆丁溶液濃度C在0.010 8～0.0648 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A有良好的線性關(guān)系。

1.2.2 微波法提取石仙桃總黃酮 稱取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，一定條件下提取，減壓抽濾，回收濾液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待測溶液。取待測溶液5 mL， 加入15 mL 70%乙醇，搖勻，即稀釋4倍。取稀釋液2 mL，按“1.2.1”方法顯色，制成10 mL顯色液及空白對(duì)照，在510 nm下測定其吸光度A，按回歸方程計(jì)算出樣品溶液中的總黃酮含量（mg/mL），根據(jù)稀釋倍數(shù)及樣品質(zhì)量換算出樣品中總黃酮的含量（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波提取功率對(duì)石仙桃總黃酮提取量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按液料比（V/m，下同）20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間15 min，提取溫度70 ℃，分別在功率100、200、300、400、500、600、700 W條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖1（圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，下同）。從圖1可以看出，當(dāng)微波功率小于300 W時(shí)，總黃酮提取量隨微波功率增大而增加，當(dāng)微波功率大于300 W時(shí)，總黃酮提取量隨微波功率增大而減小，這主要是因?yàn)楫?dāng)微波功率較低時(shí)，通過吸收微波能量產(chǎn)生熱量的極性分子吸收的能量少，產(chǎn)生的熱量低，細(xì)胞內(nèi)溫度上升得慢，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力小，細(xì)胞膜的破碎度低，導(dǎo)致總黃酮的提取量低，隨著功率的增大，細(xì)胞膜的破碎程度不斷增大，總黃酮的提取量也隨之增大，但細(xì)胞膜的破碎度不可能無限增大，當(dāng)微波功率繼續(xù)增大時(shí)，總黃酮可能會(huì)分解，其他雜質(zhì)的溶解也會(huì)增加，故后續(xù)試驗(yàn)微波功率選定300 W。

2.1.2 微波提取時(shí)間對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃，分別在時(shí)間10、15、20、25、30、35、40 min條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)提取時(shí)間低于30 min時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨提取時(shí)間的增加而增大，當(dāng)提取時(shí)間超過30 min時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨提取時(shí)間的增加而減少。這可能是因?yàn)榧訜釙r(shí)間較短時(shí)，細(xì)胞內(nèi)極性分子吸收的微波能量較少，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力較小，對(duì)細(xì)胞膜被破壞的程度較小，故總黃酮提取量不高；隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)極性分子吸收的微波能量增加，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力增大，細(xì)胞膜被微波破壞程度加大，但時(shí)間過長，雜質(zhì)的溶解也會(huì)增加，乙醇揮發(fā)量增加，總黃酮提取量下降，因此確定后續(xù)試驗(yàn)提取時(shí)間為30 min。

2.1.3 提取溫度對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時(shí)間30 min，液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，分別在溫度40、50、60、70、80、90 ℃條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見表1。從表1可以看出，60 ℃時(shí)石仙桃總黃酮含量最高，80 ℃時(shí)石仙桃總黃酮含量次之。

2.1.4 液料比對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時(shí)間30 min，溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，分別在液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)液料比低于20∶1時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨液料比的增加而增大，當(dāng)液料比高于20∶1時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨取液料比的增加而減少。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時(shí)間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖4。從圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于80%時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于80%時(shí)，石仙桃總黃酮提取量隨取乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減少。這是因?yàn)樵谥参镏?，黃酮類化合物多以苷類形式存在，黃酮苷元極性較小，糖基極性較大，根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，部分酯溶性黃酮溶解量增加。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，水溶性黃酮的溶解度降低，并且乙醇體積分?jǐn)?shù)較高會(huì)使細(xì)胞蛋白質(zhì)很快凝固，不利于乙醇向細(xì)胞內(nèi)滲透，溶解并釋放細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)，使總黃酮提取率下降。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 微波提取石仙桃總黃酮的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步考察各因素對(duì)石仙桃總黃酮提取量影響程度，以及得出微波提取石仙桃總黃酮的最佳工藝條件，由于微波功率較低時(shí)，即300 W左右時(shí)，石仙桃的提取量已較高，為節(jié)約能源，將微波提取的最佳功率定為300 W。故只選擇提取時(shí)間、溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素為主要影響因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，選用L9（34）正交表探究提取時(shí)間、溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響程度大小及微波提取法的最佳工藝條件。L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果見表2。

由表2正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在微波功率為300 W條件下，各因素對(duì)石仙桃總黃酮含量的影響從大到小為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溫度、液料比。由表2極差分析可知，石仙桃總黃酮含量的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即微波功率為300 W，時(shí)間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證性試驗(yàn)

精確稱取石仙桃樣品2.000 g，在最佳工藝條件A2B2C2D2下，按“1.2”的試驗(yàn)方法操作，測定吸光度，并計(jì)算石仙桃總黃酮提取量。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到的驗(yàn)證結(jié)果為在最佳工藝條件下，總黃酮的提取量為31.41 mg/g，RSD為0.85%。說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)

在中草藥中黃酮類化合物提取方法主要有浸漬法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法等。相比之下，微波法具有提取效率高、節(jié)省溶劑、污染小等優(yōu)點(diǎn)。微波法提取石仙桃總黃酮的工藝研究，單因素試驗(yàn)得出的最佳條件為微波功率為300 W，時(shí)間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，對(duì)時(shí)間、溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)后，得出的結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，且測定的黃酮含量的方法穩(wěn)定可靠，總黃酮的提取量可達(dá)31.41 mg/g。

參考文獻(xiàn)：

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社2006.

[2] 田 超.福建細(xì)葉石仙桃主要化學(xué)成分及其生物活性初步研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[3] 易綺斐，刑福武，陳紅鋒，等.我國石仙桃屬植物的分布和開發(fā)利用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（3）：94-97.

[4] 廖彭瑩，李 兵，苗偉生，等.細(xì)葉石仙桃揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（22）：13394-13395.

[5] 馬雪梅，章 萍，于蘇萍，等.云南石仙桃及石斛總生物堿和多糖含量的分析[J].中草藥，1997，28（9）：561-563.