紅外光譜結(jié)合相關(guān)性分析對(duì)番茄病害葉的研究

摘要：用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合相關(guān)性分析研究番茄正常葉片和3種病害葉片。結(jié)果表明，它們的主要物質(zhì)成分為蛋白質(zhì)、多糖和脂類物質(zhì)。正常葉片、葉霉病、晚疫病和煤污病葉片的光譜整體相似，僅在1 750～700 nm，正常葉片與病害葉片光譜的峰位、峰形及吸收強(qiáng)度比有一定差異，吸收強(qiáng)度比A■/A■為0.727、0.515、0.591和0.719，表明病害葉片中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量升高，而糖類物質(zhì)的相對(duì)含量降低。為提高光譜靈敏度，對(duì)光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)相關(guān)性分析，4個(gè)樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1 750～1 500 cm-1和1 200～900 cm-1的相關(guān)系數(shù)差異明顯，表明4種葉片樣品所含化學(xué)成分結(jié)構(gòu)或各成分相對(duì)含量各不相同，即病害影響了番茄葉片的化學(xué)成分。上述研究結(jié)果表明，傅里葉變換紅外光譜結(jié)合相關(guān)性分析在鑒別番茄病害葉片方面具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：傅里葉變換紅外光譜；番茄病害；葉片；相關(guān)分析

中圖分類號(hào)：O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2120-03

番茄（Solanum lycopersicum L）又稱西紅柿，是茄科茄屬一年或多年生草本植物[1]。番茄富含維生素、番茄紅素、胡蘿卜素、鈣、磷、鉀、鋅及有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，栽培中具有廣適性和高產(chǎn)性，使其成為提高人民生活水平、加快經(jīng)濟(jì)發(fā)展和分布廣泛的重要蔬菜作物之一[2]。生產(chǎn)過程中許多生物和非生物因素都會(huì)導(dǎo)致番茄植株感染各種病害，從而對(duì)番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)造成影響。目前中國(guó)蔬菜生產(chǎn)中廣泛存在盲目與隨意使用農(nóng)藥的現(xiàn)象，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量，這與中國(guó)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的目標(biāo)不相符[3]，主要原因在于不能及時(shí)、準(zhǔn)確鑒別病蟲害及判斷其危害程度[4]。

傳統(tǒng)農(nóng)作物病害鑒定主要采用目測(cè)法，即根據(jù)植物外部表現(xiàn)的癥狀進(jìn)行判斷，這需要豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)還存在主觀性強(qiáng)、誤差大的缺點(diǎn)[5]；較先進(jìn)的檢測(cè)方法有病原物分離培養(yǎng)、顯微形貌觀察、分子生物學(xué)等，上述方法雖能準(zhǔn)確鑒定病害，但過程復(fù)雜，操作繁瑣，成本較高[6]。近年來傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)能直接反應(yīng)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，特征性強(qiáng)、靈敏度高、測(cè)試時(shí)間短，能對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量無損分析[7]，已應(yīng)用于農(nóng)作物病害的研究，如FTIR對(duì)病害煙葉、蠶豆病害葉、油菜根腫病、稻瘟病、玉米銹病和蠶豆銹病葉的研究[4，5，8，9]等，紅外光譜法研究番茄病害方面鮮見報(bào)道。本研究基于FTIR技術(shù)，結(jié)合相關(guān)性分析對(duì)番茄正常葉片、晚疫病、葉霉病和煤污病葉片病斑的紅外光譜進(jìn)行研究，探討比較不同葉片所含化學(xué)信息差異，從不同光譜區(qū)進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為番茄病害的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與測(cè)試條件

光譜儀為PE公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，裝備DTGS檢測(cè)器，掃描次數(shù)16次，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，光譜數(shù)據(jù)用OMNIC 8.0軟件處理，數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用軟件SPSS 18.0。

1.2 樣品制備與光譜預(yù)處理

番茄葉片均采自玉溪市紅塔區(qū)研和鎮(zhèn)，經(jīng)農(nóng)業(yè)科技術(shù)人員鑒定，自然晾干，病害葉片取病斑部、正常葉片取與病害葉取樣相同或相近部位。將干燥葉片樣品放入瑪瑙研缽磨為細(xì)粉，再按1∶50的質(zhì)量比加入溴化鉀溶劑并攪磨均勻，然后壓片測(cè)定光譜。所有光譜均扣除背景光譜，并用OMNIC 8.0軟件進(jìn)行自動(dòng)基線校正、自動(dòng)平滑和自動(dòng)歸一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉片的紅外光譜特征

正常葉片和病害葉片的紅外光譜見圖1，主要吸收峰見表1。其中，a是正常葉片；b是葉霉病葉片；c是晚疫病葉片；d是煤污病葉片，所有光譜均以3 425 cm-1附近吸收峰為參考進(jìn)行歸一化處理。由圖1可知，3種病害葉片和正常葉片的主要譜峰峰形相似，最強(qiáng)峰均為O-H和N-H伸縮振動(dòng)疊加峰。為便于比較，將光譜分為5個(gè)區(qū)，在3 700～3 000 cm-1區(qū)，顯示羥基和蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶中-NH伸縮振動(dòng)的3 424 cm-1附近寬吸收峰[10]；3 000～2 800 cm-1是甲基和亞甲基的伸縮振動(dòng)區(qū)，顯示脂肪化合物中甲基反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)區(qū)在2 926和2 850 cm-1附近吸收峰[11]； 在1 750～1 500 cm-1的酰胺和羰基振動(dòng)區(qū)中，1 738 cm-1峰歸屬脂類羰基伸縮振動(dòng)，1 636 cm-1附近吸收峰主要來自蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶中C=O伸縮振動(dòng)，1 545 cm-1附近吸收峰歸屬蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶中N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)吸收[12]；1 500～1 200 cm-1主要是蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、脂肪酸及多糖的混合振動(dòng)區(qū)[13]，其中1 440～1 370 cm-1附近寬吸收峰主要?dú)w屬蛋白質(zhì)、木質(zhì)素和纖維素中甲基、亞甲基受氧、氮原子影響的對(duì)稱彎曲振動(dòng)及CH3剪式振動(dòng)[14]，1 250 cm-1附近吸收峰主要來自蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶中C-N伸縮振動(dòng)及N-H變形振動(dòng)吸收；1 200～700 cm-1主要為多糖和糖類異構(gòu)體吸收區(qū)[4]，正常葉片光譜在該范圍內(nèi)顯示由1 147、 1 095、1 076和1 052 cm-1 4個(gè)階梯增強(qiáng)峰，煤污病葉片則顯示了3個(gè)階梯增強(qiáng)峰，分別位于1 151、1 076和1 043 cm-1附近，而葉霉病葉片和晚疫病葉片則只顯示一個(gè)峰，分別位于1 102和1 076 cm-1附近，表明病害減少了番茄葉片中多糖類物質(zhì)的組分和含量，尤以葉霉病和晚疫病的病原黃枝孢菌和致病疫霉菌的影響最大。5個(gè)區(qū)中，強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在1 750～1 500 cm-1區(qū)和1 200～700 cm-1區(qū)，說明番茄葉片的主要物質(zhì)成分是蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)，4種葉片光譜在1 500～1 200 cm-1和1 200～700 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收峰的峰位、峰形和峰強(qiáng)差異較大，說明4種葉片中所含蛋白質(zhì)和多糖的組分和（或）含量差異較大。

2.2 特征吸收峰的分析與比較

由圖1可知，正常葉片和病害葉片光譜差異主要表現(xiàn)為：①2 926和2 850 cm-1附近吸收峰相對(duì)強(qiáng)度按正常葉片、煤污病、晚疫病和葉霉病葉片的規(guī)律逐漸增強(qiáng)；②在1 738 cm-1附近的脂類羰基振動(dòng)吸收峰處，只有煤污病葉片顯示明顯肩峰，而正常葉片、葉霉病和晚疫病葉片沒有出現(xiàn)此肩峰；③在1 750～700 cm-1，4種葉片光譜的最強(qiáng)峰均出現(xiàn)在酰胺Ⅰ帶吸收區(qū)，且以正常葉片吸收峰的波數(shù)最高，為1 636 cm-1，分別比晚疫病、葉霉病和煤污病葉片高2、6和10 cm-1。第二強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在多糖吸收區(qū)，正常葉片，葉霉病、晚疫病和煤污病葉片吸收峰分別為1 051、1 101、1 076和1 043 cm-1，相應(yīng)的吸收強(qiáng)度比A■/A■值依次為0.727、0.591、0.719和0.515，表明病害葉片中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量升高，而糖類物質(zhì)的相對(duì)含量降低；④在1 548 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶吸收峰處，只有正常葉片顯示一個(gè)肩峰，病害葉片中為出現(xiàn)此吸收峰，說明病害葉片中含有的酰胺大多為叔酰胺[15]；⑤在1 500～1 200 cm-1吸收區(qū)，正常葉片顯示4個(gè)強(qiáng)度依次增強(qiáng)的小吸收峰組成的階梯峰，并在922 cm-1處有一個(gè)小肩峰，煤污病葉片在此范圍內(nèi)的最強(qiáng)峰為強(qiáng)度相當(dāng)?shù)碾p峰，葉霉病和晚疫病則均只顯示一個(gè)吸收峰，分別位于1 102和1 076 cm-1處，利用此特征可將正常葉片、煤污病葉片與葉霉病和晚疫病葉片區(qū)別開；同時(shí)由于葉霉病葉片在1 318 cm-1處有一個(gè)肩峰，而晚疫病葉片沒有，利用這些特征可將葉霉病和晚疫病葉區(qū)別開。

2.3 二階導(dǎo)數(shù)光譜的相關(guān)性分析

正常葉片和煤污病葉片光譜、葉霉病葉片和晚疫病葉片光譜差異并不十分明顯，從光譜圖上只能靠幾個(gè)特征吸收峰來區(qū)別，為更客觀、全面地區(qū)別它們，分析它們的相似程度，分別對(duì)4個(gè)樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜在1 750～1 500 cm-1和1 200～900 cm-1做相關(guān)性分析。

在1 750～1 500 cm-1的酰胺和脂類羰基振動(dòng)區(qū)，不同葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜差異較大，相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，正常葉片與葉霉病葉片在此范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)光譜相似度很高，相關(guān)系數(shù)為0.906，晚疫病和煤污病葉片的則較差，相關(guān)系數(shù)僅為0.680，說明病害使番茄葉片中所含蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)的組分和（或）相對(duì)含量發(fā)生了變化。

1 200～900 cm-1范圍內(nèi)多糖振動(dòng)區(qū)二階導(dǎo)數(shù)光譜相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，不同葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜在該范圍差異也很大，葉霉病與晚疫病和煤污病葉片的相似性較好些，相關(guān)系數(shù)分別為0.802和0.858，其余葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜間的相關(guān)性都較差，相關(guān)系數(shù)都小于0.800，正常葉片與晚疫病葉片的最差，僅為0.614，說明病害改變了番茄葉片中糖類物質(zhì)的組分和（或）相對(duì)含量。4種葉片樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜的相關(guān)系數(shù)有一定差異，表明病害影響了番茄葉片所含化學(xué)物質(zhì)的組分和（或）各組分的相對(duì)含量。

3 小結(jié)與討論

對(duì)番茄正常葉片和病害葉片進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜研究，表明番茄葉片的主要物質(zhì)成分為蛋白質(zhì)、多糖和脂類化合物。正常葉片與病害葉片的原始紅外光譜雖在蛋白質(zhì)、多糖的特征吸收帶存在差異，但差異不明顯，二階導(dǎo)數(shù)相關(guān)性分析在1 750～1 500 cm-1和1 200～900 cm-1差異顯著。因此，通過紅外光譜技術(shù)結(jié)合相關(guān)性分析能鑒別不同的番茄病害葉片。正常番茄葉片與3種病害葉片二階導(dǎo)數(shù)光譜相關(guān)系數(shù)的差異表明病害影響了番茄葉片的物質(zhì)成分的組分和（或）相對(duì)含量，同時(shí)3種病害葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜的相關(guān)性差異表明不同病害對(duì)番茄葉片物質(zhì)成分的組分和（或）相對(duì)含量的影響不同。研究結(jié)果表明，傅里葉變換紅外光譜在鑒別番茄葉片病害種類和研究病害對(duì)番茄葉片主要物質(zhì)成分的影響方面具有快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳世儒.蔬菜作物育種[M].重慶：西南大學(xué)出版社，1994.

[2] 徐鶴林，李景富.中國(guó)番茄[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[3] 鄭建秋.現(xiàn)代蔬菜病蟲害鑒別與防治手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[4] 李志永，劉 剛，李 倫，等.蠶豆病害葉的FTIR研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（5）：1217-1220.

[5] 任先培，劉 剛，周在進(jìn)，等.病害煙葉的傅里葉變換紅外光譜研究[J].激光與紅外，2009，39（9）：944-947.

[6] 詹剛明，王建峰，王曉杰，等.中國(guó)小麥條銹菌生理小種演化及遺傳重組[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（9）：1815.

[7] 吳瑾光.近代傅里葉變換紅外光譜技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1994.

[8] 劉 飛，劉 剛.油菜根腫病的傅里葉變換紅外光譜研究[J].光散射學(xué)報(bào)，2013，25（2）：192-197.

[9] 歐全宏，趙興祥，周湘萍，等.稻瘟病、玉米銹病和蠶豆銹病葉的傅里葉變換紅外光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（9）：289-292.

[10] DZIYBBA B，BABUCHOWSKIA A，DOROTA N，et al. Identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and cluster analysis[J]. International Dairy Journal，2007（17）：183-189.

[11] AMIALI N. M，GOLDING G. R，SEDMAN J，et al.Rapid identification of community associated methicillin resistant Staphylococcus by fourier transform infrared spectroscopy[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2011，70：157-166.

[12] 孫素琴，周 群，陳建波.中藥紅外光譜的分析與鑒定[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[13] 劉 剛，劉劍虹，宋鼎珊，等.野生食用蕈菌不同部位的紅外光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2005，25（7）：1053-1056.

[14] 楊貫羽，張敬華，鄒衛(wèi)華，等.梧桐樹葉吸附銅離子前后紅外光譜分析比較[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2006，23（2）：390.

[15] 孫素琴，周 群，秦 竹.中藥二維相關(guān)紅外光譜鑒定圖集[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.