基于多反應監(jiān)測模式下的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素殘留

摘 要：本文的目的是建立動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素殘留量的檢測方法，樣品經(jīng)EDTA-Mcllvaine緩沖液提取、PEP固相萃取柱凈化，通過Thermo Fisher Hypersil Gold C18（內徑100×2.1mm，粒徑1.7μm）進行分離，再用0.2%甲酸水溶液和甲醇乙腈溶液（體積比為40∶60）洗脫體系分離目標化合物，將目標化合物的保留時間、前體離子、子離子碎片及其相對豐度作為定性依據(jù)，選擇響應穩(wěn)定性好、信號強的子離子碎片作為定量離子，基質外標法定量。結果表明，19種氟喹諾酮類藥物在2～100ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.995；加標回收率在60%～120%，相對標準偏差均<20%。因此判定，該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，符合動物源性食品中多種氟喹諾酮類殘留量的檢測要求。

關鍵詞：多反應監(jiān)測 氟喹諾酮 動物源性食品 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用

氟喹諾酮類抗生素藥物的發(fā)展歷史可以追溯到50多年前[1]。氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）是人工合成抗菌藥[2-4]，又稱吡啶酸類、沙星類藥物，是喹諾酮藥物的第三代發(fā)展產物，主要包括恩諾沙星（Enrofloxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依諾沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、吡哌酸（Pipemidic acid）、萘啶酸（Nalidixic acid）、奧索利酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、西諾沙星（Cinoxacin）、單諾沙星（Danofloxacin，又名丹諾沙星、達氟沙星）、馬波沙星（Marbofloxacin）、氟羅沙星（Fleroxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）等。氟喹諾酮類藥物具有抗菌、抗支原體、抗球蟲等作用，可有效預防和治療動物泌尿生殖系統(tǒng)疾病、胃腸疾病，以及呼吸道、皮膚組織的感染性疾病，價格低、療效好[2]。但是，此類藥物在被廣泛用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖、加工貯存的過程中必然會造成動物源性食品中（如肉制品、牛奶、雞蛋等）該類抗生素藥物的殘留[5-10]，人們長期食用此類食品可能導致身體出現(xiàn)細菌耐藥性、過敏、中毒、致癌、致畸、致突變等嚴重傷害[11-14]。

近年來，由于部分養(yǎng)殖戶和經(jīng)營者為了躲避食品抽查而不斷變換或更新氟喹諾酮類抗生素的使用品種，致使動物源性食品中該類抗生素殘留超標問題時有發(fā)生，針對這一現(xiàn)象，擴大此類抗生素檢測范圍的探索應與時俱進。本文旨在建立超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法以同時檢驗出動物源性食品中19種氟喹諾酮類抗生素的殘留量，優(yōu)化檢驗方法、提高檢驗效率、擴大檢驗范圍，以期為在動物源性食品中開展多種抗生素殘留的檢測提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Thermo TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher科技公司）、臺式高效冷凍離心機（鹽城市安信實驗設備有限公司）、多管渦旋混合均質器（美國Thermo Fisher科技公司）、真空過柱裝置（天津市津騰實驗設備有限公司）、氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）、百分之一電子天平（奧豪斯）、PEP固相萃取柱（200mg、6mL，博納艾杰爾）。

試劑：Quinolone Mix19（100μg/mL）：Enrofloxacin、Norfloxacin、Pefloxacin、Ciprofloxacin、Ofloxacin、Sarafloxacin、Enoxacin、Lomefloxacin、Pipemidic acid、Nalidixic acid、Oxolinic acid、Flumequine、Cinoxacin、Danofloxacin、Marbofloxacin、Fleroxacin、Orbifloxacin、Sparfloxacin、Difloxacin，均購自BEIJING MANHAGE BIOTECH（編號C0006319）；供試試劑有乙腈、甲醇、甲酸，均為HPLC級；氫氧化鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉均為優(yōu)級純；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

樣品：市售豬肉20份、羊肉20份、雞肉10份、雞蛋10份、牛奶10份。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取

稱取試樣5.00g（精確到0.01g）置于50mL聚丙烯離心管中，加入15mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液，2500r/min渦旋混合1min，低溫（溫度低于20℃）超聲提取10min，10000r/min離心10min（溫度低于5℃），取上清液。提取3次，合并上清液，EDTA-Mcllvaine緩沖液定容至50mL。

1.2.2 凈化

PEP固相萃取柱，使用前用6mL甲醇、6mL水進行活化。將10mL提取溶液以2～3mL/min的速度過柱，用2mL 5%甲醇淋洗，棄去淋洗液；小柱真空負壓抽干（時間大于 20min），再用6mL甲醇洗脫并收集洗脫液；洗脫液于40℃下使用氮氣吹至近干，用1mL 0.2%甲酸水溶液溶解，旋渦混合1min，過0.22μm濾膜，上機待測。

1.3 基質標曲制備

1.3.1 混合標準儲備液（10μg/mL）

精密吸取19種混合標準物質各1.00mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.2 混合標準中間溶液（1μg/mL）

精密吸取混合標準儲備液1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.3 混合標準工作溶液（100ng/mL）

精密吸取混合標準中間溶液1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻備用。

1.3.4 基質標準工作曲線

分別使用不含氟喹諾酮類藥物的豬肉、羊肉、雞肉、雞蛋、牛奶作為空白基質。準確稱取陰性試樣5.00g（精確至0.01g）置于50mL聚丙烯塑料離心管中，分別加入不同體積的19種氟喹諾酮類混合標準工作溶液，然后加入EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，在渦旋混合器上混合均勻，同樣品前處理及凈化步驟，待吹至近干后，用初始比例流動相溶液定容配制成濃度分別為2、5、10、20、100ng/mL的標準系列。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18（內徑100×2.1mm、粒徑1.7um）；柱溫：40℃；進樣體積5μL；流速0.2mL/min；流動相A：0.2%甲酸水溶液，流動相B：甲醇-乙腈溶液（體積比為40∶60）。梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質譜條件

ESI正離子模式，噴霧電壓3.5kV，蒸發(fā)溫度350℃，離子傳輸管溫度350℃，鞘氣（N2）流量30arb，輔助氣（N2）10arb。

2 結果分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 樣品制備

分別采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和1%甲酸乙腈來提取豬肉、羊肉、牛奶中的19種氟喹諾酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其雖然沉淀蛋白效果較好，但會因提取到更多的磷脂而嚴重干擾出峰時間較晚的Cinoxacin、Oxolinic acid、Nalidixic acid和Flumequine，且加標回收率偏低。

采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取的樣品提取液在過PEP固相萃取柱時均出現(xiàn)了不同程度的堵塞情況，故實驗對比了過濾樣品提取液、分取樣品提取液和鎢酸鈉-硫酸沉淀樣品提取液3種方法解決凈化柱堵塞問題。結果表明，分取樣品提取液過PEP固相萃取柱實驗效率高，處理的樣品干凈，回收率高。

2.1.2 色譜質譜條件

考察了有機相為100%乙腈、100%甲醇、40%甲醇+60%乙腈的出峰分離情況。結果顯示，40%甲醇+60%乙腈在不同基質下分離度最好，目標化合物的保留時間在各種類型的基質中相對穩(wěn)定，同時可將羊肉中的環(huán)丙沙星干擾物徹底分離。

考察了水相為純水、0.2%甲酸水和5mmol甲酸銨水溶液的出峰分離情況，在水相中添加甲酸可提高儀器對目標化合物的響應且能夠改善峰形，而甲酸銨會導致背景升高，影響方法靈敏度，故選擇0.2%甲酸水。

將配制好的19種氟喹諾酮類化合物的混合標準中間溶液（1μg/mL）通過蠕動泵以5μL/min的流速注入質譜儀，調整離子源參數(shù)，待噴霧穩(wěn)定后進行Q1四極桿全掃描，找到目標化合物的前體離子，設定碰撞能5～50eV區(qū)間分9次進行碰撞，通過Q3四極桿找到儀器響應和穩(wěn)定性俱佳的定性離子和定量離子，同時進一步優(yōu)化錐孔電壓，從而建立多反應監(jiān)測模式分析方法。19種化合物質譜參數(shù)優(yōu)化結果見表2。

2.2 方法參數(shù)驗證

2.2.1 線性實驗

以牛奶為例，用空白基質提取液將混合標準工作溶液分別稀釋濃度至2、5、10、20、100ng/mL，以氟喹諾酮質量濃度作為橫坐標（X），定量離子的峰面積作為縱坐標（Y），進行線性擬合，得到基質匹配的標準曲線及相關系數(shù)，見表3。

2.2.2 方法的靈敏度

以取樣量5.00g，在上述樣品處理與色譜質譜條件下，根據(jù)3倍信噪比和10倍信噪比所對應的各氟喹諾酮藥物質量濃度為儀器的檢出限和定量限。方法中19種氟喹諾酮的檢出限為0.03～0.5μg/kg，定量限為0.1～2μg/kg。

2.2.3 方法的精密度和回收試驗

在牛奶、豬肉、雞蛋陰性樣品中分別添加0.1、20和100μg/kg這3個水平進行添加回收實驗。按照上述方法進行測定，每個添加濃度測定6次，在較低濃度下，樣品添加回收率在60%～120%，相對標準偏差<20%，方法精密度良好。

2.3 樣品測定

采用上述檢測方法，對市售豬肉、羊肉、牛奶等70份樣品中19種氟喹諾酮類藥物殘留進行檢測，檢出氧氟沙星陽性樣品1份，樣品為羊肉，含量為15.8μg/kg。

3 結論與討論

本實驗運用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極質譜聯(lián)用儀建立的多反應監(jiān)測模式下同時測定動物源性食品中19種氟喹諾酮類藥物殘留量，其靈敏度與回收率高，重現(xiàn)性好，抗干擾能力強，符合我國對喹諾酮類藥物殘留的監(jiān)管要求，能夠為食品安全風險監(jiān)測工作提供準確有效的理論依據(jù)。

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