基于MALDI-TOF MS檢測肺泡灌洗液病原菌分布和耐藥性分析

朱明輝 王衛(wèi)華 呂綺 鄭琳

[摘要] 目的 了解呼吸危重癥醫(yī)學(xué)科和重癥監(jiān)護病房（Intensive care unit，ICU）肺部疾病患者支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）病原菌種類及其耐藥性。 方法 回顧性分析2017年1月～2018年12月我院呼吸危重癥醫(yī)學(xué)科和ICU肺部疾病患者BALF分離的病原菌種類及耐藥性情況。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）對病原菌進行鑒定。 結(jié)果 BALF陽性檢出率為17.80%（162/910），共分離培養(yǎng)出病原菌191株，其中真菌98株（51.31%），以念珠菌、曲霉菌和新生隱球菌為主;革蘭陰性桿菌共90株（47.12%），以鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌為主，多藥耐藥鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為58.33%，對頭孢哌酮/舒巴坦和替加環(huán)素的耐藥率分別為45.83%、16.67%，對哌拉西林/他唑巴坦及頭孢類藥物的耐藥率均大于54.0%。其他革蘭陰性桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率不高。 結(jié)論 基于MALDI-TOF MS鑒定的BALF病原菌種類多樣，以真菌和革蘭陰性桿菌為主，其中鮑曼不動桿菌多藥耐藥現(xiàn)象嚴重。病原菌的準確鑒定和敏感藥物使用為臨床提供治療依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 支氣管肺泡灌洗液;革蘭陰性桿菌;真菌;耐藥性;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜

[中圖分類號] R446.5;R563.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）05-0141-04

Analysis of distribution and drug resistance of pathogenic bacteria in alveolar lavage fluid based on MALDI-TOF MS

ZHU Minghui WANG Weihua LV Qi ZHENG Lin

Department of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Ningbo University Medical College， Ningbo 315000， China

[Abstract] Objective To understand the pathogens and drug resistance of Bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in patients with respiratory diseases and intensive care unit（ICU）. Methods The pathogens and drug resistance of BALF isolated from patients with respiratory critical medical disease and ICU lung disease in our hospital from January 2017 to December 2018 were retrospectively analyzed. Pathogenic bacteria were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）. Results The positive detection rate of BALF was 17.80%（162/910）. A total of 191 pathogens were isolated and cultured， among which 98 strains（51.31%） were fungi， mainly Candida， Aspergillus and Cryptococcus neoformans. Gram-negative bacilli 90 strains（47.12%） were isolated and cultured， mainly Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae. The resistance rates of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii to imipenem and meropenem were all 58.33%.? The resistance rates to cefoperazone/sulbactam and tigecycline were 45.83% and 16.67%， respectively， and the resistance rates to piperacillin/tazobactam and cephalosporins were more than 54.0%. The resistance rate of other Gram-negative bacilli to commonly used antibiotics was not high. Conclusion The pathogens of BALF identified by MALDI-TOF MS are diverse， mainly including fungi and Gram-negative bacilli. The multidrug resistance of Acinetobacter baumannii is serious. The accurate identification of pathogenic bacteria and the use of sensitive drugs provide clinical treatment basis.

[Key words] Bronchoalveolar lavage fluid; Gram-negative bacilli; Fungi; Drug resistance; Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

下呼吸道感染可由多種病原菌引起，是醫(yī)院感染發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]。在臨床上，肺部疾病患者病原菌檢測主要依靠痰液標本的培養(yǎng)，由于留取痰液標本時的各種限制，導(dǎo)致合格率較低，痰液對下呼吸道感染的診斷價值不高，診斷導(dǎo)致肺部疾病的病原菌的可靠性較差。而BALF標本取自病灶部位，污染少，有明顯優(yōu)勢。BALF微生物培養(yǎng)已被證明是確定下呼吸道感染病原菌的可靠方法，其分離微生物接近于臨床的診斷金標準，因此被廣泛開展[2-3]。隨著臨床上多藥耐藥菌及少見病原菌（如諾卡菌、隱球菌和絲狀真菌等）的出現(xiàn)，為臨床治療帶來壓力，因此明確病原菌種類和準確的抗菌藥物的使用，能夠減少治療的失敗率和控制耐藥現(xiàn)象發(fā)生。本研究使用MALDI-TOF MS對病原菌進行鑒定，分析BALF病原菌檢查結(jié)果和耐藥特性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料? 收集2017年1月～2018年12月我院呼吸危重癥醫(yī)學(xué)科和ICU肺部感染患者的BALF標本。其中男90例，女72例，年齡21～92歲，平均63歲。同一患者肺泡灌洗液選用首次分離菌。

1.1.2 儀器和試劑? VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK 2-Compact自動化微生物儀及配套GN334/335、GP67藥敏卡購自法國梅里埃公司;基質(zhì)液α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）和甲酸購自法國梅里埃公司;哥倫比亞和巧克力血瓊脂平板購自鄭州安圖生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和培養(yǎng)? 支氣管肺泡灌洗術(shù)（Bronchoalveolar lavage，BAL）《參照肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》[4]進行BALF的灌洗留取。微生物培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版[5]要求進行。質(zhì)控菌株為：銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC7000603、大腸埃希菌 ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923，均來自國家衛(wèi)健委臨檢驗中心。藥敏結(jié)果判讀參照最新的美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準進行。

1.2.2 MALDI-TOF MS鑒定細菌和酵母菌? 用一次性消毒牙簽挑取血平板或沙保弱瓊脂平板生長18～24 h的單菌落涂抹于靶板，加1 μL CHCA基質(zhì)蓋過靶點（酵母菌先加0.5 μL甲酸），干燥后質(zhì)譜鑒定。

1.2.3 MALDI-TOF MS磁珠法鑒定絲狀真菌? 用蘸濕乙醇的棉簽收集1～2 cm直徑范圍內(nèi)沙保弱瓊脂平板上絲狀真菌菌落，懸于900 μL 70%的乙醇離心管中，同時加入酒精高度1/2的磁珠。渦旋震蕩1～2 min，棄去磁珠，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液。加40 μL新鮮配制的70%甲酸，渦旋震蕩均勻，再加40 μL乙腈渦旋震蕩均勻，12 000 r/min離心2 min。 取上清1 μL涂布于靶板上（雙孔），自然干燥后加1 μL CHCA基質(zhì)，干燥后質(zhì)譜鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析和儀器校正? 采用WHONET 5.5軟件進行藥敏結(jié)果統(tǒng)計。MALDI-TOF MS鑒定病原菌前，用大腸埃希菌ATCC 8739作為標準菌株進行儀器校正。

2 結(jié)果

2.1 肺部疾病患者BLAF病原菌種類和構(gòu)成比

在910例患者中，162例BALF培養(yǎng)陽性，檢出率17.80%;162例中男性90例，占55.56%，女性72例，占44.44%。共分離培養(yǎng)出病原菌191株，真菌98株（51.31%），其中白色念珠菌45株（23.56%），曲霉23株（12.04%）;革蘭陰性桿菌共90株（47.12%），以鮑曼不動桿菌（12.57%）、銅綠假單胞菌（10.47%）、肺炎克雷伯菌（6.28%）為主;革蘭陽性球菌中金黃色葡萄球菌3株（1.57%）。見表1。

2.2 BLAF病原菌耐藥情況

鮑曼不動桿菌對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在50%以上。銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率分別為20.00%、8.33%。嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌對頭孢他啶、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶和米諾環(huán)素的耐藥率均低于10%。見表2。

3 討論

支氣管肺泡灌洗術(shù)（Bronchoalveolar lavage，BAL）是一種無創(chuàng)技術(shù)，研究中BAL結(jié)合虛擬導(dǎo)航，可以直達病灶處，有針對性灌洗足量的標本，提高病原菌的檢出率，對下呼吸道感染診斷更具價值，還可用于診斷各種肺疾病，如間質(zhì)性肺疾病、重癥肺部感染和肺部惡性腫瘤等[6]。文中BALF病原菌的檢出率低于李金等[7]的報道，推測還有病毒或支原體等感染發(fā)生。近年來，MALDI-TOF MS作為新興技術(shù)，能快速、準確鑒定微生物，且鑒定微生物種類多，在真菌、奴卡菌和少見菌的鑒定方面具有明顯優(yōu)勢，大部分菌株可以鑒定到種[8]。文中MALDI-TOF MS對灌洗液標本病原菌的檢出種類顯著高于相關(guān)報道[2，7，9]，以革蘭陰性桿菌和真菌為主，革蘭陰性桿菌主要由鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌構(gòu)成，與2015年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)[10]報道結(jié)果一致;真菌由念珠菌、曲霉、隱球菌、奴卡菌和其他少見真菌構(gòu)成。早期明確病原菌的種類，為臨床治療提供理論依據(jù)。

在鑒定絲狀真菌時，使用了磁珠法，克服了菌絲和細胞壁破碎困難的難題，提高了鑒定的準確率。而對于少數(shù)鑒定不出的真菌，推薦更新VITEK 3.2數(shù)據(jù)庫及使用實驗室內(nèi)部自建庫來彌補不足。相關(guān)研究也報道與基因檢測結(jié)果相比，MALDI-TOF MS能夠可靠地鑒定出臨床絲狀真菌[11-12]。臨床上抗絲狀真菌藥物主要是三唑類藥物、多烯類藥物、氟胞嘧啶和棘白菌素類藥物等，有報道發(fā)現(xiàn)唑類藥物耐藥率有所上升，耐藥機制主要包括藥物靶點靶位點cyp51a和非cyp51a突變及其過度表達、生物膜的形成和外排泵的上調(diào)，因此有必要及時開展絲狀真菌藥敏檢測[13]。酵母菌中白色念珠菌檢出率達23.56%，明顯高于相關(guān)研究[2]，文中BALF標本多來自老年患者，基礎(chǔ)疾病多、住院時間長、長期使用大量廣譜抗菌藥物及有侵入性操作，研究表明[14]這幾方面是下呼吸道念珠菌的定植或感染的危險因素。因此念珠菌肺炎的診斷需慎重考慮，需從宿主因素、患者臨床表現(xiàn)及微生物學(xué)三方面綜合考慮，尤其是免疫缺陷患者[15]。而有研究指出造血干細胞移植肺炎患者BALF念珠菌培養(yǎng)陽性者與炎癥水平和死亡率顯著相關(guān)[16]。因此念珠菌的分離應(yīng)引起醫(yī)生的重視。

文中BALF分離細菌多為革蘭陰性桿菌，可能與老年患者較多，第三、四代頭孢菌素的廣泛使用有關(guān)。革蘭陰性桿菌中，多藥耐藥鮑曼不動桿菌比例較高，共識中[17]舒普深和特治星作為推薦治療藥物。而文中對頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦耐藥率高于45%，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為58.33%，其復(fù)雜的耐藥機制主要為產(chǎn)OXA型碳青霉烯酶或外膜蛋白改變（缺陷或表達水平下降）或外排泵表達，因此治療多藥耐藥鮑曼不動桿菌應(yīng)依據(jù)藥敏結(jié)果選擇敏感藥物，聯(lián)合藥物治療;對于泛耐藥鮑曼不動桿菌選擇舒普深或替加環(huán)素為基礎(chǔ)的聯(lián)合藥物治療，考慮到中國定制藥敏卡中替加環(huán)素耐藥率有所偏高，因此使用替加環(huán)素治療前需進行肉湯稀釋法或MIC測試條確證。本文中20株銅綠假單胞菌中有6株為黏液性銅綠，雖然體外耐藥率較低，但考慮生物膜的存在，臨床治療效果不佳，推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物與敏感性藥物聯(lián)合治療[18-19]。嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌是醫(yī)院機會致病菌，文中對頭孢他啶和左旋氧氟沙星的耐藥率低于史格[20]的報道，但考慮到左旋氧氟沙星容易誘導(dǎo)細菌耐藥，應(yīng)謹慎使用。臨床上舒普深也常作為治療藥物，由于其沒有折點，僅報告藥敏的數(shù)據(jù)結(jié)果供醫(yī)生參考。考慮到兩種細菌廣泛的固有耐藥和復(fù)雜的獲得性耐藥機制，且容易形成生物膜，二者引起的醫(yī)院感染僅有少量抗菌藥物用于治療，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測藥敏變化[21]。

綜上所述，MALDI-TOF MS的應(yīng)用增加了BALF病原菌檢出種類，為臨床提供了明確的病原菌。革蘭陰性桿菌藥敏結(jié)果多樣性，應(yīng)結(jié)合藥敏結(jié)果指導(dǎo)治療。同時要加強醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生、控制環(huán)境污染和接觸隔離，以防止耐藥性微生物在呼吸危重癥醫(yī)學(xué)科和ICU內(nèi)傳播。

[參考文獻]

[1] Collaborators GL. Estimates of the global，regional and national morbidity，mortality and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries，1990～2016：A systematic analysis for the global burden of disease study 2016[J]. Lancet Infect Dis，2018，18（11）：1191-1210.

[2] 李秀文，王運鐸，張毅華. 肺泡灌洗液、纖支鏡刷出物及痰病原菌培養(yǎng)對下呼吸道感染的診斷價值[J]. 中國實驗診斷學(xué)，2018，22（12）：2091-2094.

[3] Escribano Montaner A，García de Lomas，Juan，et al. Bacteria from bronchoalveolar lavage fluid from children with suspected chronic lower respiratory tract infection：Results from a multi-center，cross-sectional study in Spain[J].European Journal of Pediatrics，2018，177（2）：181-192.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會. 肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2017，40（8）：578-583.

[5] 尚紅，王毓三，申子瑜. 全國臨床檢驗操作規(guī)程[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：.

[6] Houda Gharsalli，Mouna Mlika，Imen Sahnoun. The utility of bronchoalveolar lavage in the evaluation of interstitial lung diseases：A clinicopathological perspective[J]. Journal Of Thoracic Disease，2018，35（5）：280-287.

[7] 李金，李光. 支氣管肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)分布及耐藥性分析[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，21（3）：242-244.

[8] Tsung Hou，Chuan Ahiang-Ni，Shih-Hua Teng. Current status of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical microbiology[J]. Journal Of Food And Drug Analysis，2019， 27（2）：404-414.

[9] 俞國峰，嚴一核，應(yīng)利君. ICU肺部感染患者肺泡灌洗液病原菌分布及耐藥性分析[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018， 56（7）：89-92.

[10] Xiang Tang，Meng Xiao，Chao Zhuo，et al. Multi-level analysis of bacteria isolated from inpatients in respiratory departments in China[J]. Microbial Pathogenesis，2018，10（5）：2666-2675.

[11] Park JH，Shin JH，Choi MJ，et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry for identification of 345 clinical isolates of Aspergillus species from 11 Korean hospitals：Comparison with molecular identification[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2017，87（1）：28-31.

[12] Atalay A，Koc AN，Suel A，et al. Conventional morphology versus PCR sequencing，rep-PCR，and MALDI-TOF-MS for identification of clinical aspergillus isolates collected over a 2-Year period in a university hospital at Kayseri，Turkey[J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis，2016， 30（5）：745-750.

[13] Sharma C，Chowdhary A. Molecular bases of -antifungal resistance in filamentous fungi[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2017，50（5）：607-616.

[14] Pendleton KM，Dickson RP，Newton DW，et al. Respiratory tract colonization by candida species portends worse outcomes in immunocompromised patients[J]. Clinical Pulmonary Medicine，2018，25（6）：197-201.

[15] Pappas PG，Kauffman CA，Andes DR，et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis：2016 Update by the Infectious Diseases Society of America[J]. Clinical Infectious Diseases，2015，62（4）：409.

[16] Díez-Aguilar M，Ekkelenkamp M，Morosini MI，et al. Antimicrobial susceptibility of non-fermenting Gram-negative pathogens isolated from cystic fibrosis patients[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2019，53（1）：84-88.

[17] 周華，周建英，俞云松. 中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識解讀[J]. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2016，16（1）：26-29.

[18] 李代昆，李具瓊，余雪梅，等. 黏液型銅綠假單胞菌臨床分布與耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017， 27（12）：2645-2648.

[19] 謝國艷，高志生，李星軍，等. 黏液型銅綠假單胞菌的毒力基因、產(chǎn)金屬酶檢測與耐藥性研究[J]. 中國實驗診斷學(xué)，2018，22（1）：121-124.

[20] 史格，茅國峰. 重癥監(jiān)護病房與普通病房主要非發(fā)酵菌耐藥性比較分析[J]. 中國消毒學(xué)雜志，2018，35（4）：276-279.

[21] Pollini S，Di Pilato V，Landini G，et al. In vitro activity of N-acetylcysteine against Stenotrophomonas maltophilia and Burkholderia cepacia complex grown in planktonic phase and biofilm[J]. PLoS ONE，2018，13（10）：e0203941.

（收稿日期：2019-07-04）