磁性介孔氧化鋯載藥體系的制備及其抗肺癌活性研究

彭延波，葉昌邦，陶燦，鄧淑君，林潔柔，許匯成，盧煥俊，劉冰，趙平

(廣東藥科大學(xué)1.醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山528458； 2.藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目前，化療仍然是癌癥治療最重要的手段，然而化療藥物的全身毒性、耐藥性和低選擇性等缺點(diǎn)導(dǎo)致治療效果并不理想[1-2]。近年來，關(guān)于制定新的治療方案來提高化療治愈率和降低毒副作用的研究受到了廣泛關(guān)注[3-5]，磁性納米粒子是其中一種引起科研人員濃厚興趣的方案，可用于多功能磁共振成像(MRI)、靶向藥物遞送、磁熱療等領(lǐng)域[6]，特別是超順磁性納米粒子可以用于構(gòu)建核殼結(jié)構(gòu)的核心，充分發(fā)揮包括藥物遞送、靶向治療和成像等在內(nèi)的多種功能，是目前的研究熱點(diǎn)[7-8]。

在化療藥物中，以阿霉素、道諾霉素為代表的蒽環(huán)類藥物被證實(shí)對80%的實(shí)體腫瘤具有殺傷效果[9]。然而，隨著用藥劑量的增加，藥物在正常細(xì)胞中殘留而導(dǎo)致的不良反應(yīng)也愈加突出。因此，臨床迫切希望能尋求安全有效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物運(yùn)載方式[10-11]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本文以超順磁性Fe3O4納米粒子為磁核、ZrO2為殼層制備納米復(fù)合體系用于固載蒽環(huán)類抗腫瘤藥物道諾霉素，考察該載藥體系對諾霉素的運(yùn)載情況，并對其抗肺癌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的運(yùn)輸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

FeCl3、FeCl2(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；二甲基亞砜(DMSO)、NH4Cl(分析純，上海試劑一廠)；谷胱甘肽(GSH)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)均為分析純，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；丁二酸酐(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇鋯(80%)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，99%)、嗎啉乙磺酸(MES，99%)均由麥克林公司提供；道諾霉素(DNM，分析純，Sigma公司)；噻唑蘭(MTT，碧云天生物科技公司)。

人肺癌細(xì)胞A549由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院獲得。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米顆粒Fe3O4的制備

取2.0 g FeCl3和0.95 g FeCl2溶解于100 mL去氧離子水中，通入氮?dú)猓跈C(jī)械攪拌器的攪拌下，將反應(yīng)體系升溫至80 ℃回流并恒溫?cái)嚢?0 min后，迅速加入25%(體積分?jǐn)?shù)，下同)氨水，將pH調(diào)節(jié)至10～11，高速攪拌40 min后，停止反應(yīng)，磁場分離，用去離子水洗滌至中性，即得磁性納米Fe3O4顆粒。

1.2.2 磁性介孔二氧化鋯(MZr)的合成

取100 mg Fe3O4磁性納米顆粒分散于裝有100 mL乙醇和100 mL去離子水混合溶液的三口燒瓶中，快速加入25%氨水2 mL，在室溫下攪拌10 min，逐滴加入5 mL溶有100 μL正丁醇鋯的乙醇溶液，室溫下機(jī)械攪拌24 h，加入70 mL溶有350 mg CTAB的乙醇溶液，繼續(xù)攪拌24 h。

反應(yīng)結(jié)束后，磁場分離出黑色的磁性納米粒子，用溶有600 mg NH4Cl的100 mL乙醇和30 mL去離子水溶液轉(zhuǎn)移到250 mL的三口燒瓶內(nèi)，在80 ℃下攪拌回流1 h，回流2次以徹底去除CTAB?；亓鹘Y(jié)束后，分離出磁流體，并用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌，即得磁性介孔二氧化鋯(MZr)。

1.2.3 羧基修飾磁性二氧化鋯微球(CMZr)的合成

取80 mg磁性介孔二氧化鋯(MZr)納米粒子分散于150 mL乙醇中，室溫?cái)嚢?0 min之后加入1 mL APTES，繼續(xù)攪拌4 h，逐滴滴加預(yù)先備好的丁二酸酐溶液(0.25 g丁二酸酐溶于5 mL DMF中)，然后繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，去離子水洗滌，磁性分離，即得羧基修飾磁性二氧化鋯微球(CMZr)。

1.2.4 磁性介孔氧化鋯載藥微球(DNM@MMZr)的制備

取10 mg CMZr微球于試管中，加入0.6 mmol/L DNM溶液5 mL，放置于恒溫?fù)u床中避光振搖24 h，即可得到藥物固載后的載藥體系。取100 mg載藥體系分散于50 mL去離子水中，室溫下機(jī)械攪拌，用MES調(diào)節(jié)pH值至4～5，滴加0.1 mmol/L KMnO4溶液5 mL，滴加完畢后升溫到80 ℃，高速攪拌40 min后，停止反應(yīng)，磁場分離，用去離子水洗滌至中性，即得MnO2封堵后的磁性載藥微球(DNM@MMZr)。

類似方法，以空白CMZr直接用MnO2封堵，得到封堵后的空白載體MMZr。

1.2.5 DNM@MMZr微球的GSH專一性試驗(yàn)

配制濃度為8 mmol/L的KCl、NaCl、Na2SO4、Glucose、GSH及空白PBS溶液，分別加入10 mg DNM@MMZr微球，在恒溫?fù)u床中振搖1 h后，取樣、用紫外可見分光光度計(jì)測試微球在不同溶質(zhì)中475 nm處的吸光度[8]，計(jì)算DNM的緩釋率。

1.2.6 MMZr載體生物相容性研究

A549細(xì)胞接種于96孔板(7×103個(gè)/孔)中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的MMZr載體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，除去MTT，加入150 μL DMSO，在避光下置恒溫?fù)u床中振搖5 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下進(jìn)行測定[10]，檢測載體對細(xì)胞的損傷情況。

1.2.7 DNM@MMZr微球的磁靶向?qū)嶒?yàn)

A549細(xì)胞在60 mm的培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)24 h，加入100 μg/mL DNM@MMZr微球，將磁鐵放置于培養(yǎng)皿的底部，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，對培養(yǎng)皿底部有磁鐵區(qū)域(靶向區(qū))和無磁鐵區(qū)域(非靶向區(qū))用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)。

1.2.8 DNM@MMZr微球的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

marker筆在6孔板背后均勻畫出橫線，劃痕間隔0.5～1 cm，橫穿過孔。每孔穿5條線，將A549細(xì)胞鋪于24孔板，培養(yǎng)24 h后用槍頭比直尺于孔板背后的橫線劃痕，拍照。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，分別加入無血清培養(yǎng)液體與DNM@MMZr微球，培養(yǎng)24 h后，取出樣板，拍照。

1.2.9 DNM@MMZr微球的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

A549細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h(7×103個(gè)/孔)，加入不同濃度的自由DNM或DNM@MMZr微球，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，除去MTT，加入150 μL DMSO，在避光下置恒溫?fù)u床中振搖5 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下進(jìn)行測定，檢測細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNM@MMZr微球的表征

2.1.1 DNM@MMZr微球的物理表征

DNM@MMZr微球制備過程中的電極電位監(jiān)測結(jié)果見圖1?？梢姡判訤e3O4微球表面電位為-19.9 mV，二氧化鋯包埋后的MZr轉(zhuǎn)變?yōu)?1.24 mV，證明二氧化鋯的成功包埋；經(jīng)APTES修飾后，微球表面的氨基使電位升為15.6 mV；以丁二酸酐與氨基反應(yīng)后，電位轉(zhuǎn)為-15.9 mV，證明磁性微球表面成功修飾了羧基。

DNM@MMZr微球的TEM結(jié)果見圖2?？梢姡{米粒子中黑色的Fe3O4磁核清晰可見，可以清楚觀察到其表面包覆的氧化鋯殼層，納米粒子近似球形，粒徑大小適中，分散性良好，很少有團(tuán)聚現(xiàn)象，平均粒徑為100 nm左右。

以上結(jié)果表明化學(xué)包埋法制備MMZr載藥體系方法簡便，所制備的微球形貌規(guī)則，粒徑理想。

圖1 DNM@MMZr微球制備過程中的電極電位值變化

Figure 1 The Zeta potential change in the preparation process of DNM@MMZr microspheres

圖2 DNM@MMZr微球的TEM圖

Figure 2 TEM image of DNM@MMZr microspheres

2.1.2 DNM@MMZr微球的GSH刺激響應(yīng)性及MMZr載體的生物相容性

DNM@MMZr微球?qū)SH的專一響應(yīng)性釋放效率如圖3所示?？梢?，在8 mmol/L的GSH介質(zhì)中，DNM@MMZr中的DNM在24 h后釋放率達(dá)到38.3%，而在其他溶質(zhì)中，DNM的緩釋率低于10%，說明所制備的DNM@MMZr微球在細(xì)胞內(nèi)源刺激響應(yīng)對GSH具有專一性。由于腫瘤細(xì)胞中的GSH含量(10 mmol/L)高于正常細(xì)胞(4 mmmol/L)，表明DNM@MMZr微球可在細(xì)胞內(nèi)用于GSH刺激響應(yīng)控制藥物的釋放。

MMZr載體的生物相容性通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)予以評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，在載體質(zhì)量濃度高達(dá)100 μg/mL時(shí)，對A549體系仍然沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，表明所制備的MMZr載體具有較高的生物安全性。

2.2 DNM@MMZr微球的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

2.2.1 DNM@MMZr微球的磁靶向性能

將A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球培養(yǎng)后，外加磁場，從圖5可見：在0 h時(shí)，靶向區(qū)域和非靶向區(qū)域幾乎沒有差別，培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好；而共孵育24 h后，非靶向區(qū)大部分細(xì)胞仍保持形態(tài)良好，但磁靶區(qū)的DNM@MMZr微球的濃度明顯增大，細(xì)胞大多變?yōu)樾鯛钇≡谂囵B(yǎng)皿中，這是細(xì)胞死亡的重要特征。這說明在外部磁場作用下，DNM@MMZr微球在磁靶向區(qū)域的聚集能力較強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，微球中的磁核賦予了體系較強(qiáng)的磁靶向性，有望在外磁場的引導(dǎo)下，使該體系向腫瘤部位移動(dòng)。

2.2.2 DNM@MMZr微球的抗細(xì)胞遷移性能

將A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球共孵育0、24 h后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)微球的抗細(xì)胞遷移性能，結(jié)果見圖6?？梢?，在共孵育24 h 后，空白組的細(xì)胞劃痕面積由8.96×104μm2降到3.871×104μm2，面積降低了56.8%；而加藥組的面積則由7.7153×104μm2降到6.56×104μm2，面積僅降低了14.9%。對比空白組，24 h后DNM@MMZr微球組細(xì)胞向劃痕中間遷移的能力明顯降低，說明DNM@MMZr微球?qū)549細(xì)胞的遷移具有明顯抑制作用，可有效減緩腫瘤細(xì)胞的侵襲。

圖3 DNM@MMZr微球在不同介質(zhì)中的DNM釋放率

Figure 3 The DNM release ratios for DNM@MMZr microspheres in different solutions

圖4 不同MMZr載體濃度下細(xì)胞存活率

Figure 4 The cell viability in different concentations of MMZr

A、B. A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球共孵育0 h； C、D. A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球共孵育24 h。

圖5 A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球在外磁場作用下共孵育后的形態(tài)變化

Figure 5 The morphology change of A549 cells treated with DNM@MMZr microspheres in the magnetic field

A、 B. A549細(xì)胞與MMZr分別共孵育0 h和24 h； C、D. A549細(xì)胞與DNM@MMZr微球分別共孵育0 h和24 h。

圖6 A549細(xì)胞與MMZr或DNM@MMZr微球共孵育后的遷移變化

Figure 6 The migrate change of A549 cells treated with MMZr or DNM@MMZr microspheres

2.2.3 DNM@MMZr微球的抗細(xì)胞增殖能力

用MTT法對比未固載的自由DNM和DNM@MMZr微球?qū)549細(xì)胞的抗細(xì)胞增殖能力，結(jié)果見圖7。可見，在濃度和孵育時(shí)間相同的條件下，DNM@MMZr微球表現(xiàn)出比自由DNM更高的腫瘤抑制效率，其中DNM@MMZr納米微球的IC50為0.40 μg/mL，而自由DNM的IC50值為0.68 μg/mL，說明所設(shè)計(jì)的納米微球可在安全運(yùn)載DNM的基礎(chǔ)上，提高DNM的抗腫瘤效率。

圖7 A549細(xì)胞與自由DNM或DNM@MMZr微球共孵育48 h后的存活率

Figure 7 The viability change of A549 cells treated with free DNM (black) or DNM@MMZr (grey) microspheres for 48 h

3 結(jié)論

本文制備了以二氧化錳封堵的磁性氧化鋯納米體系并研究了體系對化療藥物DNM的運(yùn)載和在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的控制釋放情況，結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的體系具有較高的生物相容性、良好的磁靶向性和靈敏的GSH刺激響應(yīng)性，且比自由DNM具有更高的體外抗肺癌活性，在抗腫瘤藥物的運(yùn)載方面具有應(yīng)用潛力。