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    HPLC-MS/MS法測(cè)定人血清中伏硫西汀的濃度

    2020-05-06 11:32:10于志軍吳海根林述勝徐麗莉
    關(guān)鍵詞:工作液內(nèi)標(biāo)精密度

    于志軍,吳海根,林述勝,徐麗莉

    (佛山市順德區(qū)伍仲珮紀(jì)念醫(yī)院,廣東 佛山 528300)

    伏硫西汀分子式為C18H22N2S,化學(xué)名為1-[2-(2,4-二甲基-苯硫基)]苯基哌嗪,是一種多模式作用機(jī)制抗抑郁藥物,通過(guò)提高腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)傳遞功能產(chǎn)生抗抑郁療效[1-4],可顯著改善認(rèn)知癥狀,其認(rèn)知癥狀改善作用獨(dú)立于情感癥狀的改善[5]。伏硫西汀口服后吸收緩慢而良好,在7~11 h血藥濃度達(dá)峰值,絕對(duì)生物利用度為75%,約2周達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度,食物對(duì)其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)無(wú)影響[4]。關(guān)于伏硫西汀原料藥、制劑含量測(cè)定已有報(bào)道[6-7],但對(duì)其血藥濃度與藥動(dòng)學(xué)研究較少,且測(cè)定結(jié)果易受代謝物與結(jié)構(gòu)類似物干擾。為滿足臨床對(duì)伏硫西汀藥動(dòng)學(xué)和治療藥物監(jiān)測(cè)需求,本文采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),用蛋白沉淀法對(duì)樣本進(jìn)行前處理,建立一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定人血清中伏硫西汀濃度的方法。

    1 儀器與試藥

    伏硫西汀對(duì)照品(批號(hào):1-JSC-75-4,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.56%,加拿大TRC公司);伏硫西汀-D8對(duì)照品(批號(hào):2-GAC-69-2,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%,加拿大TRC公司);甲酸銨(質(zhì)譜純,美國(guó)Fisher公司);甲醇(色譜級(jí),德國(guó)Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水(超純水,電阻率=18 MΩ)。

    LC-20A高效液相色譜儀、LCMS-8040三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器均為日本島津公司產(chǎn)品;MS3basic渦旋器(德國(guó) IKA);SQP-SECURA125-1CN型電子分析天平(德國(guó) Sartorius);H2050R高速離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司);超純水純化系統(tǒng)(四川沃特爾設(shè)備有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜與質(zhì)譜條件

    色譜條件:色譜柱為Shim-pack VP-ODS(2.0 mm×15 cm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-5 mmoL/L甲酸銨緩沖溶液(體積比75∶25);流速為0.4 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為1 μL。

    質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源,正離子掃描模式,脫溶劑管溫度為250 ℃,加熱模塊溫度為400 ℃,干燥氣為氮?dú)猓魉贋?5.0 L/min。用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,定量分析離子對(duì)分別為m/z299.15→m/z150.10(伏硫西汀)、m/z307.25→m/z153.10(伏硫西汀-D8),碰撞能量分別為22.0、25.0 eV。伏硫西汀及伏硫西汀-D8質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對(duì)照品工作液的制備 取伏硫西汀對(duì)照品適量,精密稱定,以甲醇為溶劑,配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

    圖1 伏硫西汀(A)及內(nèi)標(biāo)伏硫西汀-D8(B)質(zhì)譜圖

    Figure 1 Vortioxetine (A) and internal standard Vortioxetine-D8 (B) mass spectrometry

    2.2.2 內(nèi)標(biāo)工作液的制備 精密稱取內(nèi)標(biāo)伏硫西汀-D8對(duì)照品適量,以甲醇為溶劑配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的儲(chǔ)備液,用50%甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

    2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密量取20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的伏硫西汀標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液5 μL至2 mL EP管中,加入95 μL空白血清,渦旋30 s,得質(zhì)量濃度分別為2、4、40、80、120、160、200 ng/mL的伏硫西汀標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。同法制備定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的血清質(zhì)控樣品,伏硫西汀的質(zhì)量濃度分別為2、6、60、150 ng/mL。

    2.3 血清樣品處理

    取血清樣品100 μL于2 mL EP管中,加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL,渦旋15 s,加入沉淀劑乙腈500 μL,渦旋1 min,以14 650 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,吸取上清液100 μL至進(jìn)樣瓶。

    2.4 專屬性試驗(yàn)

    分別取6份不同來(lái)源的未服用過(guò)伏硫西汀的正常人空白血清100 μL,不加內(nèi)標(biāo),按“2.3”項(xiàng)血清樣品處理方法處理,按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣分析,得空白樣品色譜圖。另取空白血清3份,分別加入伏硫西汀、伏硫西汀-D8及伏硫西汀+伏硫西汀-D8,按“2.3”項(xiàng)下方法處理,得色譜圖見(jiàn)圖2??梢?jiàn),伏硫西汀與伏硫西汀-D8的保留時(shí)間分別約為1.15 min和1.13 min,血清中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)干擾,專屬性好。

    A.空白血清; B.添加伏硫西汀血清; C.添加內(nèi)標(biāo)血清; D.添加伏硫西汀及內(nèi)標(biāo)血清。

    圖2 專屬性試驗(yàn)MRM圖
    Figure 2 MRM of Specific test

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

    按“2.2.3”項(xiàng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線血清樣品,按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣分析。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(y),采用加權(quán)(1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸,得到伏硫西汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.61x-1.17×10-3(r2=0.996 8),定量下限為2 ng/mL,線性范圍為2~200 ng/mL。

    2.6 精密度與提取回收率試驗(yàn)

    取“2.2.3”項(xiàng)下定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度(2、6、60、150 ng/mL)的血清質(zhì)控樣品100 μL,每個(gè)質(zhì)量濃度6份樣品,按“2.3”項(xiàng)血清樣品處理方法處理,按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣分析,求得方法批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。連續(xù)測(cè)定3 d,并與隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定,求得方法批間精密度。取低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各100 μL,按“2.3”項(xiàng)血清樣品處理方法處理后進(jìn)樣的峰面積記為A,空白樣品同法處理后、加入相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣后的峰面積記為B,每組每個(gè)質(zhì)量濃度6份樣品,提取回收率=A/B×100%。

    按《中國(guó)藥典》中“9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度,得伏硫西汀的批內(nèi)精密度為2.61%~4.53%,批間精密度為0.83%~1.97%,準(zhǔn)確度為95.48%~103.53%。在低、中、高3種濃度下,伏硫西汀的平均提取回收率為91.93%~97.26%,精密度與回收率均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求,結(jié)果見(jiàn)表1。

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取“2.2.3”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度(6、60、150 ng/mL)的血清質(zhì)控樣品,分別考察在常溫避光放置1 h和24 h、反復(fù)凍融1次和3次、-70 ℃凍存1 d和14 d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明質(zhì)控樣品在常溫光照條件下放置24 h、反復(fù)凍融3次、-70 ℃凍存7 d和14 d各條件下均穩(wěn)定,RSD均小于15%,可見(jiàn)血清樣品在各條件下均保持穩(wěn)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 血清中伏硫西汀的精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision and recovery for vortioxetine in serum

    表2 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the stability of the samples (n=3)

    2.8 基質(zhì)效應(yīng)

    分別取6種不同來(lái)源的空白血清95 μL,按“2.3”項(xiàng)下血清樣品處理方法處理,得空白基質(zhì)后,分別加入低、高(含伏硫西汀6、150 ng/mL)質(zhì)量濃度工作液5 μL與內(nèi)標(biāo)溶液20 μL,制備成基質(zhì)考察樣品,進(jìn)樣分析,得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)1。用去離子水代替血清,同法操作,得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面比值A(chǔ)2。每份血清樣品每個(gè)濃度重復(fù)制備2份,計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%的RSD值。結(jié)果伏硫西汀在低、高2個(gè)質(zhì)量濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子RSD分別為 9.01%、2.77%,均小于15%,表明該方法無(wú)明顯基質(zhì)影響。

    2.9 方法學(xué)應(yīng)用

    采用本方法測(cè)定13例未知濃度待測(cè)含藥血漿樣品,其中1例的質(zhì)量濃度低于定量下限,12例的質(zhì)量濃度均在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi),質(zhì)量濃度范圍為3.5~33.2 ng/mL,平均質(zhì)量濃度為16.35 ng/mL,與神經(jīng)精神藥理學(xué)治療藥物監(jiān)測(cè)共識(shí)指南(AGNP)[8]推薦的治療濃度范圍(10~40 ng/mL)相一致,表明大部分患者所服用的伏硫西汀達(dá)到有效濃度范圍。

    3 討論

    伏硫西汀作為新型抗抑郁藥,被美國(guó)精神病學(xué)抑郁癥治療指南、加拿大情緒和焦慮治療網(wǎng)絡(luò)成人抑郁癥管理指南和中國(guó)抑郁障礙防治指南等推薦為治療抑郁癥的一線藥物,在AGNP指南中伏硫西汀作為2級(jí)推薦,臨床需要時(shí)可進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)。采用LC-MS/MS測(cè)定人血清中藥物濃度的方法有較多的研究[9-10],但有關(guān)伏硫西汀的血藥濃度監(jiān)測(cè)方法文獻(xiàn)報(bào)道較少。

    本研究旨在建立一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確穩(wěn)定地檢測(cè)人血清中伏硫西汀的方法。在色譜條件摸索中發(fā)現(xiàn),隨著甲醇比例增加,響應(yīng)增強(qiáng),采用甲醇-水(體積比75∶25)的流動(dòng)相體系,可減少流動(dòng)相對(duì)儀器的損傷。采用乙腈蛋白沉淀法對(duì)樣品進(jìn)行處理,不但提高了靈敏度,而且有利于改善峰型。本文方法是在文獻(xiàn)[11]方法學(xué)條件下進(jìn)行了優(yōu)化,緩沖溶液中甲酸銨濃度由原來(lái)2×104mmoL/L改成5 mmoL/L,流速由1 mL/min改成0.4 mL/min,結(jié)果顯示定量下限可達(dá) 2 ng/L,分析時(shí)間縮短10 min,且具有更高的回收率(91.93%~97.26%)和更少的進(jìn)樣量(1 μL),分離效果良好,可快速對(duì)臨床樣品進(jìn)行高通量定量分析,能夠滿足臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)的要求。

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