載甘草次酸的聚乙二醇-油酸膠束的制備及制劑學(xué)研究

梁薔薇，李莉，劉艷華,2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)是甘草中主要的三萜類活性成分甘草酸的苷元，具有抗感染、抗腫瘤作用，主要用于慢性肝炎和肝癌的治療[1-3]。國外研究表明，甘草次酸及其衍生物可作為靶向肝臟的配體，因此有研究嘗試將甘草次酸作為靶向配體用于肝靶向治療[4-5]。然而，甘草次酸在水中的溶解性極差，生物利用度較低，限制了其臨床應(yīng)用。目前，甘草次酸臨床使用的制劑有注射液。關(guān)于GA給藥系統(tǒng)還有微乳、固體脂質(zhì)納米粒等研究報道[6]，雖然一定程度可以解決GA的給藥問題，但仍存在制備復(fù)雜等不足。

據(jù)文獻報道，聚合物膠束可在溶液中自組裝成疏水性內(nèi)核和親水性外殼結(jié)構(gòu)，疏水性內(nèi)核可以包裹溶解度低的藥物如甘草次酸、阿霉素等[7-9]，有效改善藥物溶解性低的問題。聚乙二醇(PEG)親水化嵌段是最常見的聚合物膠束載體，低毒且無刺激性，以PEG為親水嵌段的兩親性聚合物具有良好的生物和血液相容性、抗凝血性、抗巨噬細(xì)胞吞噬、長循環(huán)等特性[10-15]。因此，本研究采用PEG作為親水基團對疏水性油酸(oleic acid，OA)進行接枝修飾，合成并表征了兩親性聚乙二醇-油酸(PEG-OA2)高分子材料，以此聚合物為載體材料制備包載甘草次酸的聚合物膠束，以期為難溶性藥物提供一種有前景的納米給藥系統(tǒng)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試藥

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；TDL-40B低速臺式大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；DZF-6090真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；GM-1.0A隔膜真空泵(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；VORTEX-5渦旋混合器(上海市其林貝爾儀器制造有限公司)；ZS90納米粒度、Zeta電位分析儀(英國馬爾文Malvern科技有限公司)；Waters E2695高效液相色譜儀(美國沃特斯科技有限公司)；AVANCE 400M核磁共振氫譜儀(德國布魯克科技有限公司)。

甘草次酸(GA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，批號：JZ16122301，南京景竹生物科技有限公司)；PEG2000(批號：MKCF6079，美國西格瑪奧德里奇公司)；油酸(OA，批號：C0680250224)、N,N′-二環(huán)乙基碳二亞胺(DCC，批號：170802242Y)、對二甲氨基吡啶(DMAP，批號：HF709151)均由南京化學(xué)試劑股份有限公司提供；N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸[Fmoc-lys(Boc)-OH，批號：GLS171103-36802，吉爾生化上海有限公司]、NΑ,NΕ-雙(叔丁氧羰基)-L-賴氨酸二環(huán)己銨[Boc-Lys(Boc)-OH，批號：GLS160906-31105，吉爾生化上海有限公司]；二氯甲烷(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；三乙胺(上海廣諾化學(xué)科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國默克股份有限公司)。

1.2 PEG-OA2聚合物的合成

精密稱取PEG2k5 g、Fmoc-lys(Boc)-OH 5.86 g、DCC 2.58 g、DMAP 0.15 g于50 mL反應(yīng)瓶中，加二氯甲烷25 mL溶解，室溫下磁力攪拌3 d，反應(yīng)液過濾后濾液分裝入50 mL離心管，加無水乙醇至45 mL，充分振搖后放入-80 ℃冰箱冷凍(20 min)后離心(4 000 r/min，2 min)，棄去上清液于37 ℃水浴活化；再加入乙醚沉淀，重復(fù)上述操作1次，旋蒸，真空干燥；取該干燥物3.65 g，加入二氯甲烷和三氟乙酸各9 mL，室溫下磁力攪拌2 h，反應(yīng)液用同上述乙醚的操作沉淀2次后旋蒸并真空干燥。取該干燥物5.36 g、Boc-Lys(Boc)-OH 5.95 g、DCC 3.54 g、DMAP 0.21 g，TEA 350 μL，溶于27 mL二氯甲烷，室溫下磁力攪拌3 d，同上述操作用無水乙醇和乙醚沉淀2次后,旋蒸并真空干燥。再取該干燥物 1.27 g，加二氯甲烷和三氟乙酸各3 mL，室溫下磁力攪拌2 h，反應(yīng)液用同上述乙醚的操作沉淀2次，反應(yīng)液旋蒸并真空干燥。取該干燥產(chǎn)物1 g、OA 0.565 g、DCC 0.660 g、DMAP 0.039 g、三乙胺150 μL于棕色瓶，加5 mL二氯甲烷溶解，室溫下磁力攪拌3 d，同上述操作用無水乙醇和乙醚沉淀2次后旋蒸并真空干燥[16]。該干燥產(chǎn)物PEG-OA2的合成路線見圖1。

1.3 PEG-OA2聚合物的結(jié)構(gòu)表征

精密稱取PEG-OA2兩親性高分子材料5 mg，加入氘代三氯甲烷溶解，用注射器轉(zhuǎn)移至干凈的核磁管里，采用AVANCE 400M核磁共振氫譜儀鑒定PEG-OA2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4 PEG-OA2臨界膠束濃度的測定

精密稱取PEG-OA2聚合物材料10 mg，溶于1 mL二氯甲烷中，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的聚合物溶液。精密稱取尼羅紅5.7 mg，溶于10 mL二氯甲烷，得到質(zhì)量濃度為0.57 mg/mL的尼羅紅溶液；取0.57 mg/mL的尼羅紅溶液0.5 mL，加二氯甲烷49.5 mL，得到質(zhì)量濃度為0.057 mg/mL的尼羅紅溶液。將10 mg/mL的聚合物溶液用純化水稀釋成質(zhì)量濃度為0.000 1、0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5 mg/mL溶液，各加10 μL質(zhì)量濃度為0.057 mg/mL的尼羅紅溶液，氮氣吹膜，真空干燥(1 h)后分別各加200 μL PBS復(fù)溶，再加蒸餾水至3 mL，用熒光分光光度計測定熒光強度[17](激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長350～450 nm)。

圖1 PEG-OA2聚合物的合成路線
Figure 1 Synthesis scheme of PEG-OA2polymer

1.5 載藥聚合物膠束的制備

精密稱取GA 5 mg，溶解于1 mL二氯甲烷中，制得質(zhì)量濃度5 mg/mL的GA溶液。精密稱取PEG-OA250 mg，溶解于0.5 mL二氯甲烷中，制得質(zhì)量濃度100 mg/mL的PEG-OA2聚合物溶液。按照摩爾比1∶1、2.5∶1、5∶1的比例，分別取對應(yīng)體積GA溶液和PEG-OA2聚合物溶液，氮氣吹膜后真空干燥1 h，各加200 μL PBS渦旋溶解后得到不同摩爾比的載藥聚合物膠束(PEG-OA2/GA)[16]?？瞻啄z束的制備方法同載藥聚合物膠束。

1.6 PEG-OA2/GA載藥膠束粒徑和電位的測定

取PEG-OA2/GA載藥膠束溶液各100 μL，加900 μL純化水稀釋，在溫度為25 ℃下，采用ZS90納米粒度、Zeta電位分析儀測定聚合物膠束的粒徑以及Zeta電位。

1.7 PEG-OA2/GA載藥膠束的形態(tài)觀察

取空白膠束和摩爾比為5∶1的PEG-OA2/GA載藥膠束，滴加適量于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，用3%磷鎢酸負(fù)染后置于透射電鏡下觀察聚合物膠束的形態(tài)。

1.8 PEG-OA2/GA載藥膠束載藥量和包封率的測定

取不同摩爾比的PEG-OA2/GA載藥膠束，各加800 μL純化水稀釋，各等分為2份，置于離心管中，標(biāo)明對應(yīng)摩爾比例下的樣品1和樣品2溶液；取不同摩爾比例下的樣品2溶液離心(3 000 r/min，5 min)；再依次從未離心的3份樣品1溶液和已離心后的樣品2溶液中均平行各取2份溶液，每份150 μL，共得12份樣品溶液，再依次各加800 μL甲醇，經(jīng)濾膜過濾后，采用HPLC法測定樣品中藥物的含量[18][色譜條件：Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-冰醋酸(體積比53∶47∶0.1)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：233 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL]。再按以下式子計算得到包封率和載藥量：包封率=膠束中包封藥物的質(zhì)量/膠束中投入的藥物總質(zhì)量×100%，載藥量=膠束中包封藥物的質(zhì)量/(載體質(zhì)量+載藥質(zhì)量)×100%。

1.9 PEG-OA2/GA載藥膠束的穩(wěn)定性考察

取不同摩爾比的PEG-OA2/GA載藥膠束，置4 ℃冰箱保存，觀察是否有沉淀析出，記錄膠束保持穩(wěn)定的時間(d)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG-OA2聚合物的結(jié)構(gòu)表征

圖2為聚合物PEG-OA2在CDCl3中的1H NMR(CDCl3)光譜，δ2.0、1.3分別歸屬于OA結(jié)構(gòu)上的—CH2和—CH3的伸縮振動吸收峰；δ3.6歸屬于PEG結(jié)構(gòu)上的—OCH2、—OCH3的特征吸收峰；δ7.7呈現(xiàn)的吸收峰歸屬于PEG-OA2結(jié)構(gòu)中Fmoc的特征吸收峰，由以上特征峰結(jié)果表明PEG與OA通過化學(xué)鍵成功相連，OA在PEG-OA2聚合物中的接枝率為20.13%。

圖2 聚合物PEG-OA2在CDCl3中的1H NMR光譜

Figure 21H NMR spectrum of PEG-OA2polymer in CDCl3

2.2 PEG-OA2的臨界膠束濃度

臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)是表征兩親性聚合物在水中的自組裝特性和膠束的體內(nèi)外結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要參數(shù)。以PEG-OA2的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測得尼羅紅的熒光強度為縱坐標(biāo)作圖，所得曲線見圖3。由曲線的拐點確定PEG-OA2載體材料的CMC為25.2 μg/mL，此CMC值較小，表明制備的PEG-OA2兩親性載體材料在水中具有良好的自組裝能力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可作為膠束載體包載難溶性藥物，并且經(jīng)靜脈注射進入體內(nèi)后不易解聚，具有良好的血液稀釋穩(wěn)定性。

圖3 尼羅紅熒光強度與PEG-OA2聚合物濃度的關(guān)系圖

Figure 3 Plots of fluorescence intensity of nile red against PEG-OA2polymer concentration

2.3 PEG-OA2/GA載藥膠束的粒徑和Zeta電位

圖4是PEG-OA2空白膠束和PEG-OA2/GA載藥膠束的動態(tài)光散射粒徑圖，可見它們均具有較小的粒徑，分布比較集中，峰形較好,說明聚合物膠束的粒子大小比較均一。從表1可見：不同摩爾比的PEG-OA2/GA的粒徑較空白膠束的大，可能是受疏水作用力π-π共軛作用的影響，疏水性藥物GA被包裹在兩親性高分子載體材料的疏水性內(nèi)核中，藥物占據(jù)一定的空間位置，使得PEG-OA2/GA載藥膠束的粒徑總體較空白膠束的粒徑大；隨著PEG-OA2/GA摩爾比的增加，膠束的粒徑減小，這可能是因為存在分子間疏水作用力π-π共軛作用的影響，當(dāng)包載等量藥物時，增加載體材料的量，藥物被充分包裹，藥物與載藥材料結(jié)合更加緊密，分子間的空隙越小，所以載藥膠束的粒徑依次變小。另外，由表1 中的Zeta電位值可見，空白膠束及不同摩爾比的PEG-OA2/GA載藥膠束的Zeta電位均接近于0，可能是因為載體材料中PEG不帶電荷，使得PEG-OA2/GA載藥膠束的親水性外殼不帶電荷，則聚合物膠束整體的電性接近中性，所以空白膠束和載藥膠束的電位均接近于0。

2.4 PEG-OA2/GA載藥膠束的形態(tài)

圖5中A、B分別是空白膠束PEG-OA2和摩爾比為5∶1的PEG-OA2/GA載藥膠束的透射電鏡圖?？梢姡酆衔锬z束外觀圓整，多為球形或類球形粒子，大小較均一；此外，聚合物膠束粒子比粒徑儀測得的小，可能是因為在透射電鏡樣品制備過程中膠束溶液干燥，引起粒子失水而粒徑變小。

2.5 PEG-OA2/GA載藥膠束的載藥量和包封率

采用HPLC法測定不同摩爾比的PEG-OA2/GA載藥膠束的載藥量和包封率，表1結(jié)果顯示PEG-OA2/GA的摩爾比為5∶1時的包封率最好，可能是在包載相等摩爾質(zhì)量藥物的情況下載體材料的量最多，可以載藥的膠束空間更大，有更多的藥物進入載體內(nèi)核被充分包載，因而藥物包封率增大；隨著載體/藥物摩爾比的增加，載藥量依次減小，可能因為包載等量藥物時，增加載體材料的量，用于載藥以外的游離材料的量也逐漸增多，因此載藥量逐漸降低。

2.6 聚合物膠束的穩(wěn)定性

由表1結(jié)果顯示，增大PEG-OA2/GA的摩爾比，載藥聚合物膠束的穩(wěn)定性也增加，可能是因為當(dāng)包載等量藥物時，載體材料越多，通過藥物與載體之間的疏水作用力π-π共軛作用更強，藥物被包裹得越完全，使得藥物越難析出，所以增加了包載藥物聚合物膠束的穩(wěn)定性。

A. PEG-OA2； B、C、D分別為摩爾比為1∶1、2.5∶1、5∶1的PEG-OA2/GA載藥膠束。

圖4 PEG-OA2空白膠束和PEG-OA2/GA載藥膠束的粒徑圖
Figure 4 Particle sizes of blank micelles and PEG-OA2/GA

圖5 PEG-OA2膠束(A)和PEG-OA2/GA膠束(B)的TEM圖像
Figure 5 TEM images of PEG-OA2micelles (A) and GA-loaded PEG-OA2micelles (B)

表1 不同摩爾比GA/PEG-OA2載藥膠束與PEG-OA2載體的制劑學(xué)表征Table 1 Characterization of PEG-OA2 carriers and GA-loaded PEG-OA2 micelles at different PEG-OA2 and GA molar ratios

3 結(jié)論

本研究合成的新型兩親性高分子材料PEG-OA2具有良好的膠束自組裝特性，以PEG-OA2作為聚合物膠束的載體材料，用來包載甘草次酸制備的聚合物膠束具有較強的載藥能力，且穩(wěn)定性好，可以有效改善甘草次酸的溶解性，為其他難溶性藥物的納米載體系統(tǒng)研究提供一定的參考價值。