BDE-28對(duì)斑馬魚(yú)核受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究

宋靜文，靳亞茹，劉紅玲

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

2,4,4’-三溴聯(lián)苯醚(2,4,4’-tribromodiphenyl ether, BDE-28)作為高溴代多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)代謝中間產(chǎn)物之一[1]，曾在長(zhǎng)江三角洲沉積物中PBDE類物質(zhì)中檢出相對(duì)豐度最高(14%)，超過(guò)了2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether, BDE-47)[2]。BDE-28等低溴代聯(lián)苯醚還曾在我國(guó)海產(chǎn)品中檢出并且含量相對(duì)較高[3]。在長(zhǎng)江下游的16種水生生物群包括蟹類、蝦類以及各種魚(yú)類的樣本均檢測(cè)到BDE-28的存在，占所有檢出的PBDEs比例相對(duì)較高(10.9%)，這大大超過(guò)了國(guó)外的檢出頻次和濃度[4]。BDE-28在水環(huán)境中的廣泛檢出使其可能對(duì)水生生物造成潛在危害，應(yīng)該引起重視。

PBDEs的發(fā)育毒性和核受體介導(dǎo)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)已在嚙齒類動(dòng)物和水生脊椎動(dòng)物中得到了廣泛的研究，這些研究主要側(cè)重在高溴代同系物如BDE-47和BDE-99等，相比較之下低溴代的BDE-28的研究則較少，但是BDE-28同樣會(huì)對(duì)一些水生生物甚至人類健康產(chǎn)生有害影響。例如有研究發(fā)現(xiàn)，BDE-28會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育異常并且對(duì)人類嬰幼兒的神經(jīng)發(fā)育功能也有負(fù)面效應(yīng)[5-6]，有研究表明，在非洲綠猴腎細(xì)胞(CV-1)中BDE-28(100 nmol·L-1)可增強(qiáng)三碘甲狀腺氨酸(T3)誘導(dǎo)甲狀腺激素受體β(trβ)的激活，但對(duì)甲狀腺激素受體α(trα)的激活沒(méi)有增強(qiáng)作用[7]。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道人類體內(nèi)甲狀腺激素(TH)濃度與體內(nèi)BDE-28濃度相關(guān)[8]。然而，到目前為止關(guān)于BDE-28在魚(yú)類等水生脊椎動(dòng)物體內(nèi)與核受體相互作用的研究較少，所以本文選擇斑馬魚(yú)為模式生物，對(duì)其8個(gè)重要受體(包括雄激素受體(AR)、甲狀腺激素受體(TR)、芳香烴受體(AhR)、雌激素受體(ER)、糖皮質(zhì)激素受體(GR)、孕烷X受體(PXR)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR))及其相關(guān)基因展開(kāi)研究。結(jié)合計(jì)算模擬方法來(lái)研究BDE-28對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的作用，通過(guò)分子對(duì)接研究BDE-28是否能與核受體的配體結(jié)合域(ligand-binding domain, LBD)結(jié)合，進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，進(jìn)一步研究BDE-28與斑馬魚(yú)相關(guān)核受體之間的相互作用。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BDE-28(純度>99.2%)，購(gòu)自美國(guó)AccStandard公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)分析純，購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，作助溶劑；RNA抽提試劑盒(RNeasy?Mini Kit)購(gòu)于Qiagen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Omniscript RT Kit)購(gòu)自Thermo公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBR?Real time PCR Master Mix Plus Kits)購(gòu)自日本Toyobo公司。

1.2 斑馬魚(yú)胚胎收集及暴露實(shí)驗(yàn)[9]

AB型成年斑馬魚(yú)(7月齡)在斑馬魚(yú)半自動(dòng)養(yǎng)殖系統(tǒng)中培養(yǎng)，胚胎收集和暴露參照以前實(shí)驗(yàn)[9]。簡(jiǎn)要敘述如下：將BDE-28的DMSO母液梯度稀釋成系列暴露液(2、20和200 μg·L-1)，DMSO不超過(guò)暴露液體積的0.1%。將胚胎(4 hpf)進(jìn)行3個(gè)濃度3個(gè)平行暴露并配制0.1%的DMSO為對(duì)照。在120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)取樣，用RNAlater試劑固定樣品，貯存于-20 ℃低溫冰箱中備用。

1.3 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-RT-PCR)實(shí)驗(yàn)[10]

使用RNA抽提試劑盒提取各濃度組培養(yǎng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)樣品的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后使用SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒對(duì)逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增和測(cè)定。q-RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min并擴(kuò)增至40個(gè)循環(huán)，之后降溫到60 ℃保持60 s。以持家基因18S rRNA作為mRNA的表達(dá)內(nèi)參，基因表達(dá)的變化用空白對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算。采用Graphpad Prism 7軟件使用單因素方差分析(ANOVA)方法并隨后通過(guò)多重比較Tukey檢驗(yàn)方法分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基因調(diào)控倍數(shù)之間的顯著性差異，當(dāng)P<0.05時(shí)表示存在顯著性差異。

1.4 結(jié)構(gòu)模型準(zhǔn)備

在ChemDraw內(nèi)構(gòu)建BDE-28的分子結(jié)構(gòu)，利用Sybyl 7.3軟件賦予BDE-28分子Gasteiger-Hückel電荷[11]和Tripos分子力場(chǎng)[12]并使其能量最小化，選擇Powell方法設(shè)置1 000次迭代，使化合物的能量收斂到0.01 kcal·(mol·nm)-1。優(yōu)化后的化合物結(jié)構(gòu)作為后續(xù)分子對(duì)接的初始結(jié)構(gòu)。從Uniport網(wǎng)站(www.uniport.org)下載斑馬魚(yú)核受體氨基酸序列信息，選擇具有一致性且無(wú)斷鏈的結(jié)構(gòu)作為模板，在SwissModel工作站(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)通過(guò)同源模建方法，構(gòu)建斑馬魚(yú)LBD域的初始形態(tài)[13]。

1.5 核受體通路的構(gòu)建

根據(jù)之前的研究構(gòu)建8種核受體相關(guān)通路[14]。對(duì)于與AhR和ER通路相關(guān)的基因，利用安捷倫文獻(xiàn)檢索軟件，在Cytoscape軟件v3.1.1中構(gòu)建生物相互作用網(wǎng)絡(luò)[15]。其他6個(gè)核受體通路的基因網(wǎng)絡(luò)通過(guò)WikiPathways網(wǎng)站(http://www.wikipathways.org/)和SABioscien-ce基因網(wǎng)絡(luò)中心(http://www.sabiosciences.com/genenetwork/genenetworkcentral.php)檢索獲取，并與AhR和ER通路整合關(guān)聯(lián)，通過(guò)Cytoscope將其可視化為一個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)通路只顯示出被研究的基因，根據(jù)不同濃度中基因表達(dá)的顯著調(diào)控倍數(shù)，用Cytoscape中的Enhanced Graphics模塊對(duì)生成的網(wǎng)絡(luò)基因(節(jié)點(diǎn))進(jìn)行著色。

1.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用Sybyl 7.3軟件的Surflex-Dock模塊將能量最小化的BDE-28小分子對(duì)接進(jìn)斑馬魚(yú)受體LBD域。在分子對(duì)接中，采用Automatic模式搜索對(duì)接口袋，其中閾值(Threshold)和膨脹系數(shù)(Bloat)分別設(shè)置為0.5和0(默認(rèn)值)[16]。通過(guò)分子對(duì)接得到配體的10個(gè)對(duì)接構(gòu)象，選取打分值最高的構(gòu)象作為活性構(gòu)象并將之與受體結(jié)合組成復(fù)合物，在南京大學(xué)計(jì)算機(jī)中心的刀片式服務(wù)器上用Gromacs-5.1.4軟件包進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬過(guò)程中對(duì)受體分子賦予CHARMM27力場(chǎng)，配體小分子的力場(chǎng)參數(shù)使用SwissParam平臺(tái)(http://www.swissparam.ch/)處理。以距離蛋白質(zhì)-小分子配體表面至少2 nm構(gòu)建盒子，填充TIP3P水分子，即蛋白質(zhì)與溶劑邊緣至少有1 nm，并加入Na離子或Cl離子以平衡體系電荷。在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬前，系統(tǒng)先經(jīng)受5 000步的能量最小化。然后進(jìn)行2個(gè)階段平衡：以NVT和NPT來(lái)平衡系統(tǒng)。每個(gè)系統(tǒng)在NVT系綜中被模擬為500皮秒(ps)，在能量最小化的情況下從0到300 K逐漸加熱，并且在NPT系統(tǒng)中保持300 K平衡500 ps。模擬中利用Particle Mesh Ewald(PME)算法計(jì)算電相互作用，范德華力以1 nm截?cái)喟霃?。最后進(jìn)行10 ns的MD模擬，所有模擬步長(zhǎng)設(shè)置為2飛秒(fs)，并每2 ps記錄一次運(yùn)動(dòng)軌跡[17]。利用OriginLab軟件對(duì)骨架原子的均方根偏差(root-means-square deviation, RMSD)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 BDE-28對(duì)斑馬魚(yú)關(guān)鍵核受體通路調(diào)控的影響

根據(jù)之前的研究[14]，八大受體中心基因網(wǎng)絡(luò)中涉及41個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，斑馬魚(yú)胚胎暴露于BDE-28后導(dǎo)致AR、TR和AhR及相關(guān)基因發(fā)生顯著性下調(diào)，而ER及相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào)。

如圖1和圖2所示，暴露在2、20和200 μg·L-1的BDE-28下的AR(ar)基因分別顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為3.03、2.64和10.10，與AR相關(guān)的增殖相關(guān)蛋白基因2G4-b(pa2g4b)、β-連環(huán)蛋白(ctnnb1)只在200 μg·L-1的BDE-28處理下發(fā)生顯著下調(diào)，且下調(diào)倍數(shù)分別為3.30和4.43，在較低濃度(2、20 μg·L-1)下這些基因的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。然而，增殖相關(guān)蛋白2G4-a(pa2g4a)基因在3個(gè)暴露濃度下都發(fā)生了顯著下調(diào)，在由低到高暴露濃度(2、20和200 μg·L-1)下的下調(diào)倍數(shù)分別為3.77、2.58和2.01。核受體共激活因子4(ncoa4)基因在2、20和200 μg·L-13種濃度下的下調(diào)倍數(shù)分別為4.81、3.42和5.68。斑馬魚(yú)幼魚(yú)trα基因在2、20和200 μg·L-1暴露下的下調(diào)倍數(shù)分別為2.21、2.18和2.31，與TR相關(guān)的核受體共抑制因子2(ncor2)基因也在低中高3種暴露濃度下下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)分別為4.23、3.93和14.69。

圖1 斑馬魚(yú)中8個(gè)受體通路相關(guān)基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖和BDE-28暴露對(duì)基因表達(dá)的影響注：每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因，連線代表蛋白和蛋白或蛋白和DNA的相互作用關(guān)系；紅色代表基因顯著上調(diào)(P<0.05)，而綠色代表基因顯著下調(diào)(P<0.05)。Fig. 1 Interaction network shows the relationship among genes associated with eight receptor pathways of zebrafish and the expression of these genes after exposure to BDE-28Note: Nodes represent single genes, and edges indicate either protein-protein or protein-DNA interactions; the red color represents significant up-regulation (P<0.05) and the green color represents significant down-regulation of genes (P<0.05).

圖2 8個(gè)核受體通路的基因表達(dá)情況火山圖注：虛線X=-1左側(cè)和X=1右側(cè)的點(diǎn)分別代表下調(diào)倍數(shù)為2以上和上調(diào)倍數(shù)為2以上的基因；虛線Y=1.30以上的點(diǎn)表示基因表達(dá)量與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；AR表示雄激素受體，TR表示甲狀腺激素受體，AhR表示芳香烴受體，ER表示雌激素受體，GR表示糖皮質(zhì)激素受體，PXR表示孕烷X受體，MR表示鹽皮質(zhì)激素受體，PPARα表示過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體。Fig. 2 Volcano plot of gene expression profiles in each nuclear receptor pathwayNote: The dotted lines on the left of X=-1 and on the right of X=1 represent genes that are down-regulated by more than 2-fold and up-regulated by more than 2-fold, respectively; points above the dotted line Y=1.30 indicate significance (P<0.05); AR stands for androgen receptor; TR stands for thyroid hormone receptor; AhR stands for aryl hydrocarbon receptor; ER stands for estrogen receptor; GR stands for glucocorticoid receptor; PXR stands for pregnane X receptor; MR stands for mineralocorticoid receptor; PPARα stands for peroxisome proliferator activated receptor.

此外，斑馬魚(yú)AhR與其調(diào)控的相關(guān)基因也發(fā)生了顯著變化(圖1和圖2)。芳香烴受體基因(ahr2)和細(xì)胞色素P4501a1(cyp1a1)在暴露于2和20 μg·L-1的BDE-28之后顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)分別為12.65、9.23和8.33、4.35，而在最高濃度下兩者都沒(méi)有顯著變化。芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白2(arnt2)和芳香烴受體抑制因子b(ahrrb)分別只在最低濃度和最高濃度下下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為2.19和3.50，而在其他暴露濃度無(wú)顯著變化。雌激素受體(er1)基因在3個(gè)暴露濃度下都發(fā)生了顯著上調(diào)，在由低到高濃度下的上調(diào)倍數(shù)分別為12.29、12.67和15.87。雌激素受體(er2a)基因在2和20 μg·L-1的BDE-28下的上調(diào)倍數(shù)分別為10.83和17.19，但在最高濃度下其調(diào)控水平?jīng)]有受到影響。相反，er1的下游基因孕酮受體基因(pgr)和卵黃蛋白原2(vtg2)在2、20和200 μg·L-1相較于對(duì)照組顯著下調(diào)，倍數(shù)分別為3.29、2.55、3.45與4.98、3.36、3.24。BDE-28的基因影響不呈劑量效應(yīng)關(guān)系。除此之外，暴露在濃度為200 μg·L-1的BDE-28下使斑馬魚(yú)GR顯著下調(diào)，倍數(shù)為17.05，較低濃度下沒(méi)有觀察到下調(diào)現(xiàn)象。3種暴露濃度下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PXR、MR和PPAR核心受體調(diào)控有顯著的變化。

2.2 BDE-28與核受體的對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬

圖3顯示了經(jīng)拉氏圖驗(yàn)證模建的蛋白結(jié)構(gòu)良好。將BDE-28與AR、TR、AhR和ER這4個(gè)受顯著影響的核受體進(jìn)行分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬研究。對(duì)接結(jié)果顯示，BDE-28成功地與斑馬魚(yú)AR、TR、AhR和ER的LBD域?qū)?。進(jìn)一步進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)觀察斑馬魚(yú)AR、TR、AhR和ER受體和配體結(jié)合的動(dòng)態(tài)過(guò)程，模擬時(shí)間為10 ns。5 ns之后，4個(gè)受體-配體復(fù)合物趨于穩(wěn)定，復(fù)合物RMSD在5 ns后平均波動(dòng)小于0.2 nm(圖4)。對(duì)于AR，其H12鏈在5 ns之后保持穩(wěn)定(圖4)，H12鏈呈現(xiàn)“鼠夾”現(xiàn)象(圖5)。在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，配體和受體復(fù)合物出現(xiàn)“鼠夾”現(xiàn)象時(shí)，化合物可以被初步判斷為有活性。從圖6(a)可以看到，BDE-28在受體口袋中被PHE764、MET749、MET787、MET745、MET42、LEU873、LEU704、PHE876、MET780、LEU880和VAL889氨基酸殘基包圍并通過(guò)和這些氨基酸殘基形成疏水鍵與AR穩(wěn)定的結(jié)合。

分子對(duì)接模擬的結(jié)果同樣也表明，BDE-28能夠與斑馬魚(yú)TR、AhR和ER快速穩(wěn)定地結(jié)合。比如TR(圖6(b))，BDE-28位于對(duì)接口袋的中心且穩(wěn)定地保留在結(jié)合位點(diǎn)上，一個(gè)苯環(huán)位于殘基ALA266、LEU277、LEU290、ILE302和LEU279形成的疏水區(qū)域中，另一個(gè)苯環(huán)位于殘基ILE225、PHE408、LEU295、PHE404、PHE218、PHE221和PHE388形成的疏水區(qū)域中，這些氨基酸殘基與配體的苯環(huán)和Br原子形成疏水鍵。此外，BDE-28的氧原子還與氨基酸殘基HIS384形成氫鍵(鍵長(zhǎng)0.2816 nm)，這表明，BDE-28能在核受體LBD域內(nèi)穩(wěn)定地與受體蛋白結(jié)合并且發(fā)生相互作用。TR與BDE-28復(fù)合物的RMSD的波動(dòng)數(shù)值在5 ns之后小于0.2 nm(圖4)，表明配體-受體復(fù)合物已經(jīng)趨于穩(wěn)定。此外，BDE-28與AhR和ER的動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果如圖4和圖6(c)和(d)所示，且BDE-28與AhR和ER只存在疏水相互作用，沒(méi)有氫鍵生成。

3 討論(Discussion)

暴露于2、20和200 μg·L-1的BDE-28主要改變了4個(gè)核受體(AR、TR、AhR和ER)信號(hào)通路的基因表達(dá)，其中，AR和TR信號(hào)通路受影響最大。在3種濃度BDE-28處理下斑馬魚(yú)幼魚(yú)AR和ncoa4表達(dá)均顯著下調(diào)，說(shuō)明BDE-28是一種AR拮抗劑，并可能干擾魚(yú)類體內(nèi)的睪丸素產(chǎn)生[18]。在最高濃度下pa2g4b和ctnnb1以及ncoa2基因明顯下調(diào)，低中濃度下pa2g4a基因表達(dá)下調(diào)，這可能干擾了斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)信號(hào)。之前有毒性研究發(fā)現(xiàn)，BDE-28會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響[5]。作為BDE-47在魚(yú)類體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，BDE-28結(jié)構(gòu)式與母體化合物相差一個(gè)Br原子，這可能使BDE-28在干擾生物體內(nèi)生殖激素的分泌及信號(hào)通路傳導(dǎo)方面有相似的作用，從而影響有機(jī)體的生殖與發(fā)育功能。研究表明，BDE-47可與AR產(chǎn)生拮抗作用[19-20]。與BDE-47觀察到的效應(yīng)類似，BDE-28主要抑制了ctnnb1和ncoa4的表達(dá)。ctnnb1作為Wnt信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳感器，可以直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子并作用于早期胚胎，在身體一些發(fā)育過(guò)程中起核心作用[21]。睪丸中共激活因子ncoa4的表達(dá)可以調(diào)節(jié)AR對(duì)精子形成的調(diào)控，精子形成是一個(gè)雄激素與AR相互依賴的過(guò)程。有研究顯示，男性體內(nèi)精子數(shù)量、睪丸功能和睪丸大小均和體內(nèi)的PBDEs含量相關(guān)[22]。之前有研究表明，BDE-47可減少日本青鳉魚(yú)體內(nèi)精子濃度[23]；最近也有研究表明，暴露在室內(nèi)灰塵中的BDE-28可能會(huì)影響人類男性精液質(zhì)量[24]。本研究結(jié)果表明，BDE-28也可能通過(guò)AR介導(dǎo)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用。

圖3 模建斑馬魚(yú)核受體配體結(jié)合域(LBD)的拉氏圖Fig. 3 Ramachandran plot of modeled zebrafish nuclear receptors (NRs) ligand-binding domain (LBD)

圖4 骨架原子(AR)的H12鏈以及受體配體復(fù)合物的均方根偏差(RMSD)注：RMSD波動(dòng)在5 ns之后<0.2 nm。Fig. 4 The root mean square deviation (RMSD) for backbone atoms of H12 (AR) and receptor-ligand complexNote: The relative fluctuations of complex is less than 0.2 nm after 5 ns.

圖5 雄激素受體出現(xiàn)的“鼠夾”機(jī)制Fig. 5 The “mousetrap” mechanism of androgen receptor

圖6 斑馬魚(yú)(a)AR、(b)TR、(c)AhR、(d)ER核受體結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基注：紅色組分代表化合物BDE-28，綠線代表氫鍵。Fig. 6 The key amino acids residue of the nuclear receptor binding sites of zebrafish (a) AR, (b) TR, (c) AhR and (d) ERNote: The red component represents compound BDE-28, and green line is hydrogen bonds.

有研究表明BDE-28會(huì)影響人體內(nèi)的甲狀腺功能[25]，另有研究證明孕婦體內(nèi)血清中的BDE-28濃度與TH水平呈負(fù)相關(guān)[26]。而從本研究結(jié)果可以看出，斑馬魚(yú)經(jīng)過(guò)BDE-28暴露后trα受到影響，明顯下調(diào)，這說(shuō)明BDE-28可能會(huì)作用于TR。從圖1可以看出，ncor2在3個(gè)濃度下都顯著下調(diào)，其作為一種核受體共抑制因子同時(shí)也是一種轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，包含多個(gè)與核受體相互作用域，已被證明和TR、AR有相互作用[27]。此外，ncor2有將組蛋白脫乙?；刚心嫉紻NA啟動(dòng)子區(qū)域的功能，并協(xié)助核受體下調(diào)靶基因表達(dá)[28]。TR對(duì)三碘甲腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)是高親和力受體，它影響到身體生理發(fā)育的幾乎每一個(gè)過(guò)程，包括生長(zhǎng)、代謝、體溫和心率等[29]。此前對(duì)斑馬魚(yú)的研究表明，在BDE-47暴露后T4含量顯著下降而T3含量顯著上升[30]。BDE-28可能由于其結(jié)構(gòu)與BDE-47相似，影響了與TR及相關(guān)的基因表達(dá)，改變了斑馬魚(yú)TH水平，顯示BDE-28可能會(huì)造成斑馬魚(yú)的甲狀腺功能紊亂。

此外，BDE-28對(duì)斑馬魚(yú)ahr2的影響呈非劑量效應(yīng)關(guān)系，rhrrb和arnt2分別只在最高和最低濃度下有顯著下調(diào)，這可能是由于斑馬魚(yú)早期生命階段有著更高的敏感性。雌激素受體er1和er2a顯著上調(diào)，之前也有學(xué)者研究倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，BDE-28在er1和er2a檢測(cè)中表現(xiàn)出激動(dòng)活性[31]。然而，vtg2基因卻在3個(gè)濃度下明顯下調(diào)。卵黃蛋白原是卵黃的前體蛋白，可與脂類、磷酸鹽、糖和金屬離子結(jié)合，為卵黃生物胚胎發(fā)育提供必需的營(yíng)養(yǎng)和能量，卵黃蛋白原基因(vtgs)的誘導(dǎo)表達(dá)被看作卵生脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物暴露于類雌激素物質(zhì)的分子生物標(biāo)志物。這些結(jié)果說(shuō)明，AhR-ER“串?dāng)_”作用的機(jī)制十分復(fù)雜，因此，在評(píng)估環(huán)境污染物的雌激素效應(yīng)的過(guò)程中，對(duì)BDE-28通過(guò)影響ER產(chǎn)生的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)有待更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)去支持驗(yàn)證。在本研究中，斑馬魚(yú)GR只在200 μg·L-1的BDE-28濃度下下調(diào)，顯示BDE-28引起的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)可能涉及到GR信號(hào)通路。

本研究過(guò)程通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)證實(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)AR、TR、AhR和ER分析的結(jié)果。由于目前斑馬魚(yú)受體的晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，因此使用同源建模來(lái)構(gòu)建斑馬魚(yú)AR、TR、AhR和ER的LBD域初始形態(tài)。分子動(dòng)力學(xué)研究中，通過(guò)觀察AR的H12鏈和4個(gè)受體與BDE-28復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及配體在受體活性位點(diǎn)部位與關(guān)鍵氨基酸殘基成鍵作用，顯示BDE-28可以穩(wěn)定地與這些受體相互作用。核受體通路上相關(guān)基因調(diào)控變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BDE-28可能是斑馬魚(yú)AR、TR、AhR的拮抗劑和ER的激動(dòng)劑。該研究手段可以為眾多污染物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)篩查提供借鑒，研究結(jié)果可為BDE-28的風(fēng)險(xiǎn)管控提供毒理信息。