氧化石墨烯抗菌性及生物安全性研究進(jìn)展

宋雅麗，王林變，高莉,2,*，孫友誼，王海賓，趙英虎，柴艷芳

1. 中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，太原 030051 2. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001 3. 中北大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030051 4. 中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，太原 030051

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是單層碳原子以sp2雜化形式存在的二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)[1]，是石墨烯的衍生物，故具備了石墨烯易導(dǎo)熱、強機(jī)械特性等卓越的性能；同時因其表面含有豐富的含氧官能團(tuán)，如羥基、羧基和環(huán)氧基等，使得GO具有了大比表面積且表面易修飾的優(yōu)良特性，也使得其在水和大多數(shù)極性有機(jī)溶劑中具有良好的分散穩(wěn)定性、親水性和生物相容性[2]。由于GO的諸多優(yōu)良特性，目前已被批量生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用于光伏電池、抗菌和生物醫(yī)學(xué)等方面[3-5]，尤其在生物醫(yī)學(xué)方面，GO已在成像、癌癥治療和藥物輸送、疫苗增強劑等領(lǐng)域成為研究熱點[6]。但大規(guī)模的使用使得GO不可避免地流入空氣、水或土壤等環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)，不僅生態(tài)安全受到了影響，人類健康也受到了威脅，引發(fā)了公眾對GO生物安全性問題的高度關(guān)注。本文綜述了近幾年GO的抗菌性和生物安全性的研究進(jìn)展，旨在更全面地揭示其生物安全性，為GO有效安全的使用作出指導(dǎo)。

1 GO的抗菌性研究(Antibacterial research of GO)

1.1 GO的抗菌性

近年來，大量研究表明，GO對細(xì)菌、真菌和病毒均具有較強的抑菌效果，如表1所示。

由表1可知，GO對3種微生物的毒性影響來看，其對細(xì)菌的毒性最大，且均具有濃度依賴性。

但在某些情況下，GO對菌種的生長卻顯示出良好的促進(jìn)作用。Ruiz等[11]首次于2011年證明，GO可作為細(xì)菌黏附的骨架，促進(jìn)其生長、增殖和形成細(xì)菌生物膜。Varela等[12]將GO納米顆粒給予流感嗜血桿菌后，GO誘導(dǎo)了菌落形成單位(CFU)的增加。Hui等[13]發(fā)現(xiàn)，200 μg·mL-1的GO在LB培養(yǎng)基中與大腸埃希菌作用3 h后，細(xì)菌存活率可達(dá)97.95%。實驗證實，GO可以通過非共價吸附LB培養(yǎng)基中的蛋白、牛血清蛋白和色氨酸等成分，這些蛋白物質(zhì)覆蓋GO后導(dǎo)致其喪失抗菌能力。

1.2 GO的抗菌機(jī)制

GO的抗菌機(jī)制主要體現(xiàn)在5個方面。(1)GO片層上的大量含氧基團(tuán)能與組成細(xì)胞壁的糖類或者蛋白質(zhì)形成氫鍵，將細(xì)胞包裹起來使胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，從而使細(xì)胞缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而死亡。(2)GO銳利的邊緣能夠破壞細(xì)胞膜，大量胞質(zhì)流出而產(chǎn)生空腔結(jié)構(gòu)，最終能破壞細(xì)菌或真菌結(jié)構(gòu)和功能的完整性導(dǎo)致細(xì)菌死亡[14]。(3)GO可以通過非活性氧機(jī)制誘發(fā)氧化壓力，導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)被氧化，破壞細(xì)胞內(nèi)部組成致細(xì)胞死亡[15-16]。(4)氧化應(yīng)激。高濃度能完全包裹菌體，主要依賴于隔絕營養(yǎng)物質(zhì)來發(fā)揮抗菌性，但低濃度下，GO不能完全包裹菌體，所以主要靠氧化應(yīng)激對壁和膜的破壞來抗菌[6]。(5)高濃度(>3 000 mg·L-1)GO還可能通過改變細(xì)菌細(xì)胞的離子通道而使離子溶出細(xì)胞體外，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞因生理活性喪失而死亡[17]。

相比于對GO抗菌機(jī)理的研究，人們對其抗病毒機(jī)理的研究較少，有學(xué)者認(rèn)為GO的抗病毒機(jī)理主要依賴于其特有的單層結(jié)構(gòu)及其所帶的負(fù)電荷，帶負(fù)電荷的GO在病毒進(jìn)入細(xì)胞前與病毒靜電結(jié)合，其單層片狀結(jié)構(gòu)所致的鋒利邊緣導(dǎo)致了病毒結(jié)構(gòu)的破壞[10]。

此外，GO的抗菌、抗病毒性能還與其尺寸有關(guān)。大尺寸GO更容易覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞表面，從而限制細(xì)胞膜上的生命活動，比橫向尺寸小的GO抑菌效果好[18]。

2 GO的陸生生物毒性研究(Terrestrial biological toxicity of GO)

2.1 GO的陸生植物毒性效應(yīng)研究

2.1.1 GO對陸生植物的毒性

GO的排放會對環(huán)境中的植物產(chǎn)生一定影響。有研究顯示，土壤會阻隔GO的運輸，所以低濃度的GO對植物毒性是不明顯的，但在一些有陽離子存在的土壤中，GO因吸附作用會與之產(chǎn)生聯(lián)合毒性，從而影響植物的正常生長，而高濃度的GO會大量積累在植物根部，少量會進(jìn)入植物體內(nèi)的其他部位，最終影響植物的干重、含水量和葉綠體等的指標(biāo)，如表2所示。

表1 氧化石墨烯(GO)對細(xì)菌、真菌和病毒的毒性Table 1 Toxicity of graphene oxide (GO) to bacteria, fungi, and viruses

2.1.2 GO對陸生植物的毒性機(jī)制

GO對植物的毒性機(jī)制總結(jié)為以下6個方面：(1)氧化應(yīng)激；(2)通過調(diào)節(jié)植物激素對植物產(chǎn)生毒性；(3)GO和植物細(xì)胞之間的相互作用，引起與關(guān)鍵生物過程相關(guān)物質(zhì)代謝的紊亂；(4)在植物根部大量富集，阻礙了植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用[19]；(5)高濃度GO的富集可能會使環(huán)境中的滲透壓增大，從而降低根皮質(zhì)細(xì)胞的直徑并導(dǎo)致細(xì)胞收縮和變形；(6)GO抑制了碳水化合物(例如吡喃葡萄糖和麥芽糖)和氨基酸(例如纈氨酸和脯氨酸)代謝，使得不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例增加[25]。

2.2 GO的陸生動物毒性效應(yīng)研究

2.2.1 GO對陸生動物的毒性

GO一旦進(jìn)入動物體內(nèi)會隨著血液流通到身體的各個部位，不同部位對GO的敏感程度是不同的，如表3所示，所以近幾年人們通過對動物的呼吸、生殖、感官和循環(huán)等各大系統(tǒng)的大量研究來評估GO的動物毒性及其毒性機(jī)理。

表2 GO對陸生植物的毒性Table 2 Toxicity of GO to terrestrial plants

2.2.2 GO對陸生動物的毒性機(jī)制

GO對動物的毒性機(jī)制可以從以下2個方面來闡明。從細(xì)胞水平上來看，GO對動物的毒性機(jī)制總結(jié)為以下3點。(1)質(zhì)膜損傷：GO可以從雙層質(zhì)膜中抽取磷脂分子造成膜損傷，導(dǎo)致孔形成和水分子流入膜中[39]；(2)氧化應(yīng)激：這2點在GO誘導(dǎo)的動物毒性中起到了關(guān)鍵性作用[40]；(3)GO的疏水區(qū)域和膜的脂質(zhì)尾部之間的強分散相互作用[41]。從分子水平上，GO的動物毒性機(jī)制可能跟其與蛋白質(zhì)、RNA等生物大分子相互作用有關(guān)。具體的毒性機(jī)制總結(jié)為以下5點。(1)與細(xì)胞膜上的蛋白受體直接作用，封閉蛋白活性位點，影響細(xì)胞正常的信號通路，抑制蛋白功能的正常發(fā)揮[35]；(2)GO暴露通過調(diào)節(jié)某些基因在遍在蛋白連接酶復(fù)合體(APC)中的表達(dá)、調(diào)節(jié)某些蛋白的正常表達(dá)來破壞主要和次要靶器官的功能[42]；(3)形成GO-溶菌酶復(fù)合物，破壞溶菌酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)[43]；(4)干擾酶基因的轉(zhuǎn)錄過程；(5)抑制氨基酸代謝和不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例。

此外，石墨烯基材料的大小、形狀、表面性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)，濃度、聚集、劑量和制備也是可能導(dǎo)致毒性的生物學(xué)活性的決定因素。比如，較大尺寸的GO比小尺寸的GO毒性更大[44]；GO納米帶(GONRS; 310 nm×5 000 nm)比GO納米片(GONPS; 100 nm×100 nm)的毒性更強[45]。

表3 GO對陸生動物的毒性Table 3 Toxicity of GO to terrestrial animals

低濃度GO對細(xì)胞活性的促進(jìn)作用機(jī)制尚不明確，可能與GO材料本身具有豐富的含氧官能團(tuán)，水溶性好，吸附性強有關(guān)，還需在以后的研究中進(jìn)一步證明。

3 GO的水生生物毒性研究(Aquatic biological toxicity of GO)

3.1 GO的水生植物毒性效應(yīng)研究

3.1.1 GO對水生植物的毒性

GO的大量使用與生產(chǎn)，導(dǎo)致其在制造、運輸、使用和處置過程中被釋放到土壤中影響陸生生物的同時，也不可避免地釋放到水中，對水生生物造成重大不利影響，甚至影響到水生生態(tài)系統(tǒng)，將近期典型研究成果總結(jié)于表4中。

3.1.2 GO對水生植物的毒性機(jī)制

GO對水生植物的毒性機(jī)制如下。(1)氧化應(yīng)激，在這一點上與陸生植物是相似的。(2)GO不會改變水生植物的鮮重，但會嚴(yán)重抑制干物質(zhì)的增加，導(dǎo)致更高的持水率，還會抑制葉綠素的含量，上調(diào)葉綠素a/b的比值，從而影響光合作用。(3)GO還會對水生植物的微觀結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)造成干擾，誘導(dǎo)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的分離以及葉片表面微孔的形成[49]。(4)GO能夠顯著下調(diào)光系統(tǒng)Ⅱ的活性；作為半透明涂層附著于藻細(xì)胞表面，造成細(xì)胞壁和膜完整性的損傷，從而抑制了藻類的生長和光合作用[50]。(5)GO大量富集在水生植物根部，逐漸積累形成一層覆蓋物，阻礙根對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[48]，不過這一機(jī)制尚需深入研究。(6)GO可以吸附藻類中的大量營養(yǎng)素(N、P、Mg和Ca)，從而導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)耗竭[51]。另外，和陸生植物相似，GO對水生植物也會出現(xiàn)“低促高抑”現(xiàn)象，可能是由于低濃度的GO暴露能顯著增加藻細(xì)胞蛋白質(zhì)和總脂含量；還能刺激藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的合成；促進(jìn)光合色素產(chǎn)生，使光合作用增強[46]。

表4 GO對水生植物的毒性Table 4 Toxicity of GO to aquatic plants

注：EC50表示半數(shù)效應(yīng)濃度。

Note: EC50is concentration for 50% of maximal effect.

3.2 GO的水生動物毒性效應(yīng)研究

3.2.1 GO對水生動物的毒性

為了更全面了解GO對水體生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害，近幾年也有研究者報道了GO對水生動物的毒性，結(jié)果總結(jié)于表5中。

3.2.2 GO對水生動物的毒性機(jī)制

GO對水生動物的毒性機(jī)制與其對陸生動物的毒性機(jī)制是大體相同的，GO納米片引起質(zhì)膜的內(nèi)陷和穿孔，并在血細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠和內(nèi)溶酶體囊泡中發(fā)現(xiàn)GO，從而造成膜損傷，其毒性是活性氧族(ROS)介導(dǎo)的氧化損傷[59]。但由于二者在身體構(gòu)造上的細(xì)微差異與所處環(huán)境的不同，導(dǎo)致GO對水生動物的毒性機(jī)制還可能是消化道堵塞，也可能是水生動物吸收GO以后產(chǎn)生的分泌物(GOBS)造成的影響[60]，有研究顯示，因為分泌物獨特的納米板形貌，厚度約為10 nm，橫向長度為19.5～282 nm，尺寸比GO納米流體(GONS)小，表現(xiàn)出比GONS更多的負(fù)表面電荷和更低的聚集狀態(tài)，使斑馬魚β-半乳糖苷酶上調(diào)和斑馬魚胚胎線粒體膜電位損失，導(dǎo)致斑馬魚畸形甚至死亡。

表5 GO對水生動物的毒性Table 5 Toxicity of GO to aquatic animals

4 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

綜上所述，GO能夠有效抑制細(xì)菌、真菌和病毒，并且GO的抑菌性和潛在毒性均與石墨烯基材料的大小、形狀、聚集、劑量、濃度、制備、表面性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)等密切相關(guān)，且釋放到空氣中的GO大多數(shù)情況下并不是單一發(fā)揮毒性作用，而是與環(huán)境中的金屬、金屬離子等物質(zhì)相互結(jié)合，從而產(chǎn)生更大的毒性，對環(huán)境的影響與人類的潛在危害是不容忽視的，但已有研究的一些結(jié)論是相互矛盾的，仍需要進(jìn)一步的研究。且如何在極大地發(fā)揮GO應(yīng)用潛力的同時，又能夠減少其對人體健康的毒害，成為擺在研究者面前的首要問題。有研究者將GO功能化，將一些基團(tuán)(羧基、聚乙二醇(PEG)、氨基化聚乙二醇(PEG-NH2)和絲素等)交聯(lián)到GO上，產(chǎn)生的功能化GO毒性減小，具有良好的生物相容性[61-63]。因此，將GO功能化有望成為大劑量并安全使用GO的一種新方法。雖然大多數(shù)研究表明，不論是對動物還是對植物，GO的主要毒理性機(jī)制都是氧化應(yīng)激，但是還有一些其他的毒性機(jī)制有待深入的研究和進(jìn)一步的確定。本綜述將為后續(xù)GO的毒理性機(jī)制研究提供參考，進(jìn)而找到相應(yīng)的控制和解決辦法，為GO的臨床應(yīng)用提供安全性評價資料，并在此基礎(chǔ)上建立全面的、切實可行的GO使用安全評價標(biāo)準(zhǔn)。