tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的建系及其在細(xì)胞示蹤方面的應(yīng)用研究

王菲，原一桐，高淵濤，田峰，田野，李宵，李承罡，杜若琛，李鵬飛，王雅麗，王春芳*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001； 2. 南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院，南昌 330000；3. 山西省人民醫(yī)院，太原 030001； 4. 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，太原 030001)

自從1980年，Gordon等首次利用原核顯微注射法研究動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)后，對(duì)于轉(zhuǎn)基因鼠的研究便不斷深入[1-2]。其中，轉(zhuǎn)基因熒光鼠作為一項(xiàng)重大研究成果，現(xiàn)已經(jīng)變成了生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等諸多領(lǐng)域的科研基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)基因熒光鼠能夠在相應(yīng)激發(fā)光下自發(fā)熒光的特性，為科學(xué)研究提供具有更加簡(jiǎn)捷、無(wú)毒害等優(yōu)質(zhì)特點(diǎn)的生物工具以及細(xì)胞治療方面的示蹤工具[3-4]。

Tandem-dimer tomato(tdTomato)是一種來(lái)自Discosoma coral(DsRed)變體紅色熒光蛋白，相比綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，eGFP)更加穩(wěn)定，激發(fā)波長(zhǎng)也更長(zhǎng)。且與其他的DsRed衍生物相比，tdTomato也是最亮且最耐光的[5]。在國(guó)外，tdTomato紅色熒光蛋白作為穩(wěn)定的熒光標(biāo)記物，已經(jīng)成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠品系，同時(shí)也在標(biāo)記表達(dá)小白蛋白的神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)中以及其他細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行使用，但在國(guó)內(nèi)尚未展開(kāi)廣泛的應(yīng)用[6-8]。

干細(xì)胞的研究和應(yīng)用一直都是科研的熱門(mén)方向，其中干細(xì)胞的培養(yǎng)和移植治療是關(guān)鍵的兩個(gè)方面[9-10]。目前，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的對(duì)于脊髓損傷后的移植治療已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以有效減少脊髓損傷后出現(xiàn)的繼發(fā)組織受損并恢復(fù)一定的運(yùn)動(dòng)功能，這為臨床治療脊髓損傷疾病帶來(lái)了新的方向[11-13]。本課題組也一直致力于多種干細(xì)胞的研究，其中包括NSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)以及NSCs在脊髓損傷方面的應(yīng)用，所以干細(xì)胞的培養(yǎng)觀察和移植治療時(shí)的示蹤都是極為關(guān)鍵的步驟[14-16]。而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用熒光鼠來(lái)代替細(xì)胞標(biāo)記術(shù)能有效地簡(jiǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，現(xiàn)為了保障后續(xù)干細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及NSCs移植示蹤實(shí)驗(yàn)中能夠使用更為快捷、穩(wěn)定、無(wú)影響的熒光模式鼠，擬構(gòu)建tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57/BL6小鼠50只，2 ～ 3月齡，雌雄2∶1，體重24 ～ 28 g；清潔級(jí)eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠4只，2 ～ 3月齡，13 ～ 14 d孕齡，體重26 ～ 32 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(晉)2015-0001】，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(晉)2009-0004】。實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)過(guò)程和其他實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(審批號(hào)：IACUC2017-002)以及中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 儀器與試劑

PCR儀(Eppendorf AG 22331 Hamburg，德國(guó))，熒光顯微(OLYMPUS，日本)，Impactor M-Ⅲ脊髓擊打器(NYU，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force，HF240，中國(guó))，石蠟切片機(jī)(Leica RM 2245，德國(guó))，OFK-8000 A多波段LED檢查套裝(Spectronics，美國(guó))。Gateway? BP ClonaseTMII Enzyme Mix (Invitrogen，11789-020)，GatewayTMLR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix (Invitrogen，12538-120)，Anti-Nestin抗體(BOSTER，BA1289)，Anti-CD34抗體(BOSTER，bs-8996R)，Anti-CD44 抗體(BOSTER，bs-4916R)，NeuroCultTMBasal Medium(STEMCELL，18C88583)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制作

重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增attB1-tdTomato-attB2基因片段，Gateway clone構(gòu)建pDown-tdTomato轉(zhuǎn)化到Stabl3大腸桿菌中，LB平板上37℃孵育過(guò)夜。提取pDown-tdTomato與母載體PRP.Des2s在25℃下進(jìn)行LR反應(yīng)3 h，將最終的表達(dá)載體PRP.Ex2d-EF1A>tdTomato轉(zhuǎn)化到Stbl3中，完成載體構(gòu)建。制備假孕母鼠和受孕母鼠，取出受孕母鼠的受精卵。將構(gòu)建好的tdTomato表達(dá)載體通過(guò)DNA顯微注射注入受精卵原核，轉(zhuǎn)移至假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，待其自然產(chǎn)下新生鼠。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定

雙向鑒定法鑒定dTomato轉(zhuǎn)基因小鼠，在波長(zhǎng)500的多波段LED手電OF-500AC燈頭下(綠色激發(fā)光)觀察皮膚裸露處的熒光情況，同時(shí)剪取其尾尖0.5 cm，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性個(gè)體。鑒定引物：

Primer I：CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT，

Primer II：CGAGGCGGATCACAAGCAATA，

Primer III：TCAATGGGCGGGGGTCGTT。

灌注陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠后，取其腦、肝、肺、心臟、脾組織，石蠟包埋制片后，進(jìn)行HE染色，置于熒光顯微鏡下觀察各個(gè)組織的熒光表達(dá)情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的建系

取6只鑒定為陽(yáng)性的原代小鼠與野生型小鼠進(jìn)行配種繁殖，并將子代中的陽(yáng)性小鼠繼續(xù)交叉配種繁殖。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)育種，定期送檢微生物和寄生蟲(chóng)。

1.2.4 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)性狀和生化指標(biāo)

取tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血后，檢測(cè)生理生化指標(biāo)檢測(cè)，測(cè)定肝功能、腎功能、血脂等指標(biāo)，與正常野生小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)差異有無(wú)顯著性。

1.2.5 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs的分離與培養(yǎng)

取孕齡為13 ～ 14 d的tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠處死后常規(guī)消毒，取出胎鼠，剔除頭骨，剝?nèi)ブ刖W(wǎng)膜及小腦，將腦組織放入有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中吹打至組織消失，200目過(guò)濾篩過(guò)濾后，離心棄上清，加入培養(yǎng)基充分混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放于細(xì)胞恒溫箱中培養(yǎng)，每2天半量換液。待培養(yǎng)至3代后，利用免疫熒光術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干標(biāo)記蛋白Nestin的表達(dá)，驗(yàn)證培養(yǎng)所得細(xì)胞為NSCs。

1.2.6 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠提取細(xì)胞移植示蹤實(shí)驗(yàn)

收集第3代的NSCs，離心后將細(xì)胞濃度調(diào)至1×107/mL。同時(shí)制備僅將胸段9T-11T脊髓椎板切除但無(wú)任何其他損傷的小鼠模型，使用微量注射泵注入5 μL的NSCs。3 d后利用Bruker Xtreme系統(tǒng)多模式成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

1.2.7 綠色熒光小鼠BMSCs與紅色熒光小鼠NSCs的共培養(yǎng)

從eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的脛、股骨骨髓中分離出BMSCs，采取貼壁法培養(yǎng)，放于細(xì)胞恒溫箱中培養(yǎng)，每2 ～ 3天換液。傳至第3代后，利用免疫熒光術(shù)檢測(cè)細(xì)胞特異性標(biāo)志物(CD44/CD34)，并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，證明培養(yǎng)所得細(xì)胞為BMSCs。

將上述所得eGFP小鼠3代的BMSCs、tdTomato小鼠的3代NSCs均以1×106/mL的細(xì)胞密度接種于六孔板中，觀察兩種干細(xì)胞在共培養(yǎng)后能讓否穩(wěn)定的表達(dá)自身的熒光。

1.2.8 綠色熒光小鼠NSCs與紅色熒光小鼠NSCs的共培養(yǎng)

按上述方法，分別提取eGFP、tdTomato轉(zhuǎn)基因胎鼠的NSCs，常規(guī)操作后，加入統(tǒng)一培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共同培養(yǎng)。培養(yǎng)至3代時(shí)，將NSCs接種于六孔板里，觀察其貼壁分化后能否穩(wěn)定表達(dá)自身的熒光特性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的制作與鑒定

首批構(gòu)建陽(yáng)性tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠共9只，4雌5雄。新生小鼠置于OF-500AC燈頭下，陽(yáng)性小鼠自發(fā)紅色熒光，而陰性小鼠不發(fā)熒光(圖1A)。提取陽(yáng)性和陰性小鼠的DNA，凝膠電泳分析表明陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)在200 ～ 400 bp之間有雙條帶，陰性結(jié)果僅在300 ～ 400 bp之間有單條帶(圖1B)。剪取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生小鼠1 cm鼠尾進(jìn)行觀察，可見(jiàn)在白光源下鼠尾無(wú)明顯差別，在激發(fā)光下轉(zhuǎn)基因小鼠的鼠尾自發(fā)紅色熒光而正常野生小鼠無(wú)熒光表現(xiàn)(圖1C-D)。經(jīng)雙向鑒定結(jié)果顯示，激發(fā)光下能自發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因小鼠，其DNA鑒定結(jié)果亦為陽(yáng)性。

將tdTomato轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠進(jìn)行灌注，取其腦、肝、肺、心臟、脾進(jìn)行石蠟包埋制片，HE染色后鏡下觀察(圖2A-E)。再置于熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)紅色熒光的穩(wěn)定表達(dá)，表明灌注固定包埋切片等常規(guī)處理不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光表達(dá)情況(圖2a-e)。并且，對(duì)比HE染色，紅色自發(fā)熒光更能明顯的辨別各個(gè)組織切片的形態(tài)學(xué)特征。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的建系以及與正常小鼠生長(zhǎng)性狀和生化指標(biāo)的對(duì)比

轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中，期間送檢微生物和寄生蟲(chóng)，檢查結(jié)果符合清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求。轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，經(jīng)兩年繁殖，現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因鼠260余只，其中陽(yáng)性鼠有208只，總陽(yáng)性率高達(dá)80%，且已有個(gè)別小鼠一胎全為陽(yáng)性。隨機(jī)選取20只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血檢測(cè)生理生化指標(biāo)，與20只野生型小鼠進(jìn)行對(duì)比，其差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。表明tdTomato基因不會(huì)影響小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育，符合正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本指標(biāo)。(表1)

注：A：新生小鼠陽(yáng)性與陰性在激發(fā)光下的對(duì)比。B： 凝膠電泳的鑒定結(jié)果。C-D： 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生小鼠的鼠尾在正常光源下和激發(fā)光下的對(duì)比。圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果Note. A, Comparison of positive and negative new born mice under excitation light. B, Identification results of gel electrophoresis. C-D, Comparison of the tails of transgenic and wild mice under normal light (C) and excitation light (D).Figure 1 Identification results of transgenic mice

圖2 tdTomato陽(yáng)性小鼠組織切片結(jié)果Figure 2 Results of tissue sections from tdTomato-positive mice

指標(biāo)Indicator體長(zhǎng)(cm)Length (cm)體重(g)Weight (g)白蛋白(g/dL)ALB (g/dL)血清堿性磷酸酶(U/L)ALP (U/L)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力(U/L)ALT (U/L)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活力(U/L)AST (U/L)血漿尿素(mmol/L)BUN (mmol/L)肌酸激酶(U/L)CK (U/L)tdTomato10.22 ± 1.5522.12 ± 0.8335.67 ± 1.76175.33 ± 44.5040.33 ± 2.08117.33 ± 25.0111.72 ± 0.73611.67 ± 151.02WT 9.32 ± 2.1123.46 ± 1.0537.47 ± 1.35168.36 ± 40.0039.67 ± 23.67114.67 ± 12.6610.86 ± 0.57684.33 ± 127.88指標(biāo)Indicator肌酐(μmol/L)CREA (μmol/L)乳酸脫氫酶(U/L)LDH (U/L)血清膽紅素(μmol/L)TBIL (μmol/L)血清膽固醇(mmol/L)Tcho (mmol/L)甘油三酯(mmol/L)TG (mmol/L)總蛋白(g/L)TP (g/L)尿酸(μmol/L)UA (μmol/L)tdTomato32.40 ± 1.70573.00 ± 86.2613.48 ± 2.012.33 ± 0.130.75 ± 0.2254.53 ± 1.6389.03 ± 19.61WT39.46 ± 0.27559.35 ± 95.7613.95 ± 6.442.39 ± 0.350.68 ± 0.2053.30 ± 0.7295.96 ± 15.72

2.3 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs的鑒定

圖3A和3a可見(jiàn)細(xì)胞球在綠色激發(fā)光下自發(fā)紅色熒光，表明細(xì)胞在體外培養(yǎng)至3代仍然可以穩(wěn)定的自發(fā)紅色熒光；圖3B和3b可見(jiàn)細(xì)胞球呈現(xiàn)綠色熒光，即細(xì)胞球呈現(xiàn)Nestin抗原陽(yáng)性；圖3C和3c可見(jiàn)明顯的藍(lán)色熒光，即Hochest對(duì)細(xì)胞核的染色，以上數(shù)據(jù)證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。

圖3 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs的鑒定結(jié)果Figure 3 Identification results of NSCs from tdTomato transgenic mice

2.4 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠提取細(xì)胞移植示蹤實(shí)驗(yàn)

收集第3代的NSCs，注入小鼠的胸段脊髓中，3 d后利用Bruker Xtreme系統(tǒng)多模式成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，可見(jiàn)小鼠的注射部位有紅色熒光信號(hào)(圖4)。表明tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光表達(dá)穩(wěn)定，能夠支持活體細(xì)胞移植示蹤實(shí)驗(yàn)，可提供實(shí)驗(yàn)需要的觀察和數(shù)據(jù)。

圖4 tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs移植示蹤成像圖Figure 4 Tracer imaging of NSCs transplantation in tdTomato transgenic mice

2.5 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將eGFP綠色熒光小鼠的3代BMSCs，分別置于OF-365AUV燈頭下(藍(lán)紫色激發(fā)光)及正常光源下觀察，視野內(nèi)可見(jiàn)自發(fā)綠色熒光的梭形貼壁細(xì)胞，分布均勻且形態(tài)纖長(zhǎng)，與BMSCs的形態(tài)學(xué)特征相符(圖5A、5a)。經(jīng)過(guò)免疫熒光化學(xué)鑒定，可見(jiàn)圖5b中的紅色熒光呈現(xiàn)出與圖5B中綠色熒光細(xì)胞基本相吻合的規(guī)則細(xì)胞形態(tài)，表示CD44陽(yáng)性；圖5c中可見(jiàn)零散的紅色背景噪音，與圖5C中的綠色熒光細(xì)胞相比，無(wú)任何細(xì)胞形態(tài)，表示CD34陰性。

注：A-C： BMSCs在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。a： BMSCs在正常光源下的觀察圖。b：BMSCs的CD44陽(yáng)性鑒定。c：BMSCs的CD34陰性鑒定。圖5 BMSCs培養(yǎng)以及鑒定結(jié)果Note. A-C, Expression of green fluorescent protein in BMSCs under fluorescence microscope. a, Image of BMSCs under normal light. b, CD44 positive cells of BMSCs. c, CD34 negative cells of BMSCs.Figure 5 Culture and identification results of BMSCs

將eGFP小鼠3代BMSCs和tdTomato小鼠3代NSCs接種同一蓋玻片上共培養(yǎng)，分為4、12、24、48 h進(jìn)行拍攝記錄(圖6)。接種4 h后，可見(jiàn)紅色NSCs與綠色BMSCs尚未分化；12 h后可見(jiàn)紅色NSCs呈不規(guī)則圓形，綠色BMSCs也開(kāi)始分化；24 h后可見(jiàn)紅色NSCs和綠色BMSCs均有明顯的分化，且分化的過(guò)程中，兩種干細(xì)胞的分化末枝會(huì)交疊纏繞在一起；48 h后可看到大片紅色NSCs和綠色BMSCs分化后交疊在一起的細(xì)胞培養(yǎng)圖，紅綠熒光顏色明顯，表明tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的紅色熒光，在參與兩種熒光干細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，能夠穩(wěn)定表達(dá)自身的紅色熒光，不會(huì)因?yàn)楦杉?xì)胞的分化而猝滅也不會(huì)受到異色熒光的干擾。

圖6 紅色NSCs和綠色BMSCs共培養(yǎng)4、12、24、48 h的分化情況Figure 6 Differentiation of red NSCs and green BMSCs in co-culture for 4, 12, 24 and 48 h

取tdTomato、eGFP轉(zhuǎn)基因胎鼠的腦源原代NSCs，共培養(yǎng)于同一培養(yǎng)瓶中，傳至3代后接種于多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的蓋玻片上觀察(圖7)。接種4 h后，可見(jiàn)NSCs球紅綠相間且呈不規(guī)則圓形；1 d后，細(xì)胞球可見(jiàn)分化末枝，且紅綠均有，表明兩種NSCs的分化較為同步；2 d后，可見(jiàn)紅綠色NSCs均有較多分化末枝，且疊加交織在一起。說(shuō)明NSCs球可由多個(gè)異源NSCs聚集而成，并非只能由單個(gè)NSCs增殖而成。

圖7 紅色NSCs和綠色NSCs共培養(yǎng)4 h、1 d和2 d的分化情況Figure 7 Differentiation of red NSCs and green NSCs in co-culture for 4 h, 1 d and 2 d

3 討論

隨著現(xiàn)代科研水平的發(fā)展和深入，干細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用也是研究者面臨的問(wèn)題。但凡涉及到干細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或者干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)，均會(huì)使用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)。但是細(xì)胞標(biāo)記術(shù)大多存在穩(wěn)定性差，會(huì)被一些物理化學(xué)等因素破壞降解，或者隨著被標(biāo)記細(xì)胞的增殖分化造成熒光的衰減，使其很難維持長(zhǎng)時(shí)間的高標(biāo)記率，從而影響在實(shí)驗(yàn)中對(duì)時(shí)間的掌控等問(wèn)題[17]。例如使用慢病毒轉(zhuǎn)染來(lái)構(gòu)建表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，操作復(fù)雜、過(guò)程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作要求較高，并且轉(zhuǎn)染后可能影響細(xì)胞活性。對(duì)于大量需要熒光標(biāo)記細(xì)胞且重復(fù)率高的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建是一勞永逸的解決方法。本課題組在之前的研究中，已經(jīng)成功構(gòu)建了eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，并完成一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了轉(zhuǎn)基因熒光小鼠在各種實(shí)驗(yàn)中，其熒光蛋白均能穩(wěn)定表達(dá)，不會(huì)因?yàn)槎嗑奂兹┕潭ɑ蛘呤灠竦瘸Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)操作而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的減弱或丟失[18-19]。

目前，NSCs雖然在脊髓損傷后的移植治療已被證實(shí)是有效的，但其在實(shí)際中的獲取及使用會(huì)涉及到倫理學(xué)等問(wèn)題，這也阻礙了在臨床應(yīng)用中的發(fā)展[11-13]。而B(niǎo)MSCs是一類(lèi)細(xì)胞來(lái)源多、分化范圍廣、免疫原性低的干細(xì)胞[20]。因此誘導(dǎo)BMSCs使其分化為NSCs或神經(jīng)元從而解決NSCs在臨床中的倫理問(wèn)題成為了一種替代解決辦法[21]?，F(xiàn)本課題組為了研究NSCs和BMSCs共培養(yǎng)后對(duì)BMSCs分化的影響，仍需另外一種熒光鼠，進(jìn)行雙色熒光共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。故本研究選取了相比eGFP表達(dá)更穩(wěn)定、熒光亮度更強(qiáng)的tdTomato紅色熒光蛋白，tdTomato已被證實(shí)相比eGFP更適合用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞遷移以及組織切片的觀察，可以作為eGFP的最佳替代品[22]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)也有實(shí)驗(yàn)室完成了紅色熒光小鼠的制作，但所使用基因多非tdTomato且很少有規(guī)范建系的報(bào)道[3-4]。在后期的建系中，我們與實(shí)驗(yàn)中常用的C57近交系實(shí)驗(yàn)小鼠相結(jié)合成功構(gòu)建C57-tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠，挑選陽(yáng)性小鼠互交，完善tdTomato的近交系轉(zhuǎn)基因小鼠的建設(shè)平臺(tái)。近交系小鼠具有更純正的譜系，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的一部分，可減少誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠各常用組織可在OF-500AC燈頭下自發(fā)紅色熒光，其腦源NSCs可在體外培養(yǎng)至3代仍保持熒光的穩(wěn)定表達(dá)。后與綠色熒光小鼠的多種干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光表達(dá)的穩(wěn)定性不會(huì)因?yàn)樽陨砀杉?xì)胞的增殖分化或者細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)兩種熒光標(biāo)記蛋白互相影響而導(dǎo)致熒光表達(dá)的衰弱或猝滅，并且實(shí)驗(yàn)的時(shí)間跨度對(duì)熒光的表達(dá)水平也沒(méi)有影響。雙色NSCs的共培養(yǎng)更是說(shuō)明了，NSCs球可以由多個(gè)異源NSCs的聚合而成。另外，在干細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，部分置于藍(lán)色激發(fā)光下拍攝的細(xì)胞圖中，隱約可見(jiàn)桔色NSCs的淡影，我們認(rèn)為是由于tdTomato的熒光亮度相比eGFP強(qiáng)了3倍，是熒光蛋白中最亮的一種，且tdTomato的激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，所以相比較eGFP更容易被激發(fā)[23]，此部分不影響任何實(shí)驗(yàn)結(jié)果且更易于直觀的細(xì)胞鏡下觀察?，F(xiàn)今，已將tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠投入到實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)工具用鼠中。本課題組，結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)研究，已經(jīng)完成了雙色轉(zhuǎn)基因熒光鼠的平臺(tái)構(gòu)建，后續(xù)，本課題組將使用雙色熒光鼠來(lái)開(kāi)展對(duì)小鼠BMSCs與NSCs共培養(yǎng)后細(xì)胞分化方向的影響以及對(duì)脊髓損傷治療作用的研究。選取不同熒光顏色的BMSCs和NSCs，能更加快捷、直接地觀察到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化的狀態(tài)，省去了反復(fù)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記的繁瑣步驟，從根本上保障了被研究干細(xì)胞的一致性。同時(shí)，完善雙色轉(zhuǎn)基因熒光鼠平臺(tái)的構(gòu)建，確保能夠提供高質(zhì)量、高穩(wěn)定性、高陽(yáng)性率的熒光工具鼠。