還原型谷胱甘肽在AG129小鼠生物凈化及快速繁殖中的應(yīng)用

張帆，安學(xué)芳，趙赫，李麗，肖宇宙

(中國科學(xué)院武漢病毒研究所， 武漢 430071)

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種具有重要生理功能的三肽硫醇，在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮十分重要的生物活性作用[1]。這種化合物是許多酶反應(yīng)的輔基，是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞[2]。目前普遍認(rèn)為，雄性動物的精清中的氧自由基過多會導(dǎo)致不育，削弱精子谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，可直接導(dǎo)致精子質(zhì)膜損傷，使精子運(yùn)動能力、頂體反應(yīng)及受精能力降低甚至消失[3]。

研究表明，在小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過程中，在培養(yǎng)液中加入一定量的GSH，可以一定程度改善卵母細(xì)胞活性[4]，同時，在精子復(fù)蘇液中加入一定量GSH可以明顯提高牛、羊等家畜凍存精子的活力、形態(tài)及遺傳物質(zhì)的完整性[5]。

AG129小鼠是I型和II型干擾素受體缺失基因敲除動物品系，對寨卡病毒、登革病毒、腸道病毒等多種病毒易感[6-8]，是較為理想的病毒易感動物模型。但是，該品系小鼠在飼養(yǎng)過程中，表現(xiàn)出較明顯的繁殖障礙，每胎產(chǎn)仔數(shù)量低，無法快速獲得足夠數(shù)量動物，成為相關(guān)科學(xué)研究的瓶頸。在體外受精實(shí)驗(yàn)中，使用常規(guī)試劑獲得可移植的兩細(xì)胞胚胎效率極低。筆者通過在精子獲能液和受精液中加入GSH，并探索調(diào)整GSH的最佳濃度，成功對AG129小鼠完成體外受精并胚胎移植，為相關(guān)體外受精困難品系小鼠的生物凈化、快速擴(kuò)繁提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級AG129小鼠(雌性4周齡80只、雄性12周齡12只)由中國科學(xué)院武漢病毒研究所實(shí)驗(yàn)動物中心保存，品系引自中國科學(xué)院上海藥物研究所【SCXK(滬)2015-0004】，SPF級ICR小鼠(雌性8周齡9只)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。所有動物均飼養(yǎng)在SPF級屏障環(huán)境IVC籠盒中【SYXK(鄂)2019-0034】，所有動物自由采食和飲水。所有操作均符合中國科學(xué)院武漢病毒研究所動物實(shí)驗(yàn)倫理要求,滿足3R原則(IACUC審批號：WIVA30201902)。

1.1.2 主要試劑與儀器

PMSG、HCG購自寧波三生生物科技有限公司；HTF(Cosmobio CSR-R-B070)、KSOM(Cosmobio CSR-R-B074)購自日本Cosmo Bio公司；2,2,2-三溴乙醇(Sigma T48402)、叔戊醇(Sigma 152463)、GSH(Sigma BD8612)、M2培養(yǎng)基(Sigma M7167)、礦物油(Sigma M5310)購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

體視顯微鏡(Motic)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、小動物體溫維持儀(瑞沃德)、超凈工作臺(蘇凈安泰)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉劑的配置與使用

在超凈工作臺中將5 g 2,2,2-三溴乙醇用3.1 mL叔戊醇溶解，待充分溶解后取0.5 mL溶液加入39.5 mL生理鹽水中，充分混合后過濾待用，配置完成的麻醉劑需避光保存，小鼠麻醉時按照20 μL/g腹腔注射使用，實(shí)驗(yàn)中所有對活體小鼠的手術(shù)操作均在動物麻醉狀態(tài)下開展。

1.2.2 GSH溶液的配置

在超凈工作臺中使用HTF將GSH粉末溶解，分別配置終濃度為0、0.5、1、2 mmol/L的GSH溶液。

1.2.3 雌鼠超排及取卵

將每只AG129雌鼠腹腔注射PMSG 10IU，48 h后腹腔注射HCG 10 IU，每個GSH濃度組超排5只AG129小鼠，3次平行。注射HCG 15 h后處死超排小鼠，手術(shù)取雌鼠輸卵管，將輸卵管在無菌濾紙上短暫放置去除表面血液后，放入提前在37℃ 5% CO2中平衡好的HTF受精滴油相中。用顯微鑷固定輸卵管，用解剖針將輸卵管膨大部刺破后，被卵丘細(xì)胞包裹的卵細(xì)胞溢出，用顯微鑷將其拖入HTF培養(yǎng)液中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.4 雄鼠精子采集

將AG129雄鼠處死后，手術(shù)取附睪尾，將附睪尾在無菌濾紙上短暫放置去除表面血液，用顯微鑷將附著的脂肪組織去除后，放入提前在37℃ 5% CO2中平衡好的HTF獲能滴油相中。用顯微鑷固定附睪尾，用顯微剪切開尾部中央的附睪管，顯微鑷輕壓附睪尾，使精子從切口處流出。迅速用顯微鑷將流出的精子拖入HTF獲能滴中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，使精子獲能。

1.2.5 體外受精

在體視顯微鏡下觀察精子濃度，使用移液器輕柔沿邊緣吸取4 ～ 6 μL精子懸濁液注射入含有卵子的HTF受精滴中進(jìn)行受精，將受精滴放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。受精6 h后，將卵子移入提前在37℃ 5% CO2中平衡好的KSOM液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 移植受體準(zhǔn)備

將受體ICR雌鼠與ICR結(jié)扎雄鼠1∶1合籠，第2日檢查陰道栓，有陰道栓的可作為胚胎移植的受體動物。

1.2.7 早期胚胎形態(tài)學(xué)觀察及統(tǒng)計

受精24 ～ 28 h后，對受精卵進(jìn)行鏡檢，對2細(xì)胞胚胎、未受精卵、異常卵進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.8 2細(xì)胞胚胎收集

使用移卵針將形態(tài)完好的2細(xì)胞胚胎移入提前準(zhǔn)備好的M2培養(yǎng)基中，反復(fù)清洗3次后放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)待移植。

1.2.9 胚胎移植

將受體ICR小鼠麻醉后剃除背部左右兩側(cè)被毛，并用75%酒精消毒。在卵巢脂肪墊部位皮膚縱向剪開一切口，分離皮膚與肌肉，再將相應(yīng)部位肌肉剪開，拉出脂肪墊，卵巢、輸卵管及子宮可一并牽引出。用脂肪夾夾住脂肪墊，在體視顯微鏡下調(diào)整輸卵管位置，找到輸卵管膨大部，用濾紙?jiān)诖浦膊课蛔龊脴?biāo)記。用維納斯剪刀在輸卵管傘口與膨大部間剪一小口，將移植針沿開口朝膨大部方向插入，小心將15枚每胎移入輸卵管內(nèi)，以輸卵管中可見指示氣泡作為移植成功標(biāo)志。移植后將脂肪墊、卵巢及輸卵管小心還納回腹腔，縫合肌肉層和皮膚層，完成單側(cè)移植操作，使用相同方法將15枚胚胎移入另外一側(cè)輸卵管中。移植完成小鼠放在小動物體溫維持儀上30 min，待蘇醒后轉(zhuǎn)入IVC籠盒內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AG129小鼠體外受精添加GSH試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，不同GSH濃度組平均受精率差異具有顯著性(P< 0.05)。在精子獲能及受精過程中，HTF中不添加GSH時，AG129小鼠體外受精率為(2.30 ± 0.73)%。添加0.5 mmol/L GSH時，兩細(xì)胞胚胎數(shù)量有所增加，受精率為(20.44 ± 0.15)%。添加1 mmol/L GSH時，兩細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，受精率達(dá)到(43.35 ± 1.76)%。添加2 mmol/L GSH時，兩細(xì)胞數(shù)量有所下降，受精率為(31.77 ± 1.42)%，同時，異常卵數(shù)明顯增加，主要表現(xiàn)為多個精子頭部鉆入卵細(xì)胞透明帶，胚胎呈“毛球”狀(見圖1)，使卵細(xì)胞無法正常完成受精，最終發(fā)育為未受精卵、畸形卵或者死亡(見圖2)。

表1 AG129小鼠體外受精結(jié)果Table 1 In vitro fertilization results of AG129 mice

注：同一列中數(shù)字后字母不同者，差異具有顯著性。

Note. Pairwise comparison, the differences are significant.

2.2 移植產(chǎn)仔率分析

由表2可見，將相同數(shù)量的胚胎移植受體，均獲得了較理想的產(chǎn)仔量，不同GSH濃度組間平均產(chǎn)仔率差異無顯著性(P> 0.05)，1 mmol/L組略高。0.5 mmol/L組與和1 mmol/L組出生的仔鼠均離乳成活，2 mmol/L組仔鼠離乳前死亡1只，平均成活率為(96.30 ± 6.41)%，不同GSH濃度組間平均成活率差異無顯著性(P> 0.05)。

3 討論

目前，AG129小鼠作為干擾素受體缺失最嚴(yán)重動物，是病毒感染性動物模型的建立、病毒致病機(jī)制研究及抗病毒疫苗與藥物研究等方面科研工作中重要的實(shí)驗(yàn)材料。干擾素受體缺失，可能是導(dǎo)致該品系小鼠繁殖能力下降的原因，采用常規(guī)雌雄同籠交配方式，很難快速獲得周齡、性別均一足量的動物，成為限制相關(guān)科研活動順利開展的瓶頸。使用激素對AG129小鼠進(jìn)行超排，采用常規(guī)體外受精方法很難獲得足夠數(shù)量的胚胎進(jìn)行后續(xù)移植。

精子質(zhì)膜中含有大量不飽和脂肪酸，為精子與卵子結(jié)合提供必要的條件?；钚匝?ROS)能夠使精子質(zhì)膜過氧化，從而使精子質(zhì)膜不可逆的喪失流動性，造成精子損傷，失去受精能力[9]。GSH作為清除氧自由基的清道夫，在細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[10]。在體外受精試劑中加入一定濃度的GSH，有利于體外受精的完成。GSH固體較穩(wěn)定，但在溶液中極易受外界環(huán)境中的溫度、光照等條件影響而被氧化為不具生理活性的氧化型谷胱甘肽[11]。因此，為防止含GSH的精子獲能液氧化，必須在使用前現(xiàn)用現(xiàn)配，不可使用前期配置或使用剩余的試劑。

注：A： 正常體外受精6 h后胚胎。 B： 異常體外受精6 h后“毛球”狀胚胎。圖1 AG129小鼠體外受精6 h后胚胎Note. A, Normal embryos after 6 h of ivf. B, Abnormal “hairball” embryos after 6 hours of ivf.Figure 1 Embryos after 6 h of ivf of AG129 mice

注：A：正常體外受精24 h后胚胎。 B： 異常體外受精24 h后發(fā)育情況。圖2 AG129小鼠體外受精24 h后胚胎Note. A, Normal embryos after 24 h of ivf. B, Growth of abnormal embryos after 24 h of ivf.Figure 2 Embryos after 24 h of ivf of AG129 mice

表2 移植產(chǎn)仔率與成活率情況Table 2 Transplant birth rate and survival rate

本實(shí)驗(yàn)以Toru等[12]前期研究為依據(jù)，設(shè)計了3個含不同濃度GSH的精子獲能及受精液的實(shí)驗(yàn)組，1個不含GSH的精子獲能液及受精液的對照組，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精子獲能液及受精液中加入GSH能夠顯著提高體外受精率，當(dāng)GSH濃度為0.5 mmol/L時，受精率有所提高，當(dāng)GSH濃度為2 mmol/L時，由于精子活力過強(qiáng)，導(dǎo)致異常受精卵數(shù)量明顯增多，平均受精率下降，當(dāng)GSH濃度為1 mmol/L時，受精率最高，受精效果最好。將不同GSH濃度組獲得的2細(xì)胞胚胎分別移植受體動物，均獲得了數(shù)量較為穩(wěn)定的仔鼠。

因此，使用還原型谷胱甘肽(GSH)調(diào)節(jié)小鼠體外受精液成分，顯著提高了AG129小鼠體外受精率，良好的完成對AG129小鼠體外受精，為該品系小鼠生物凈化及快速繁殖提供了可靠的技術(shù)保障，并為后續(xù)類似問題的順利解決提供了技術(shù)思路。