D-半乳糖與L-谷氨酸誘導(dǎo)樹鼩肝組織損傷

陸姜利，郭玉倩，錢忠義，角建林，梁張*，鄭紅*

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，昆明 650500； 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)中心，昆明 650500；3. 昆明醫(yī)科大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，昆明 650031)

肝是人體新陳代謝的主要器官，具有十分重要和復(fù)雜的生理功能[1]?；瘜W(xué)物質(zhì)是導(dǎo)致臨床常見肝損傷的因素。通過胃腸道門靜脈或體循環(huán)進(jìn)入肝進(jìn)行轉(zhuǎn)化，有毒物質(zhì)使肝組織受到損害，表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死，肝功能障礙，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，甚至引起肝衰竭、肝癌、肝性腦病等[2-3]。肝疾病對人類健康危害巨大，目前肝疾病的治療仍然是世界性難題，建立實驗性肝損傷動物模型, 有助于肝疾病發(fā)病機制的研究、篩選保肝藥物。實驗性肝損傷動物模型已成為發(fā)病機制和藥物研發(fā)的重要工具。

1968年，首次報道D-半乳糖(D-galactose，D-gal)引起肝損傷[4]。目前，D-gal已被廣泛應(yīng)用于建立實驗性衰老、肝損傷等疾病模型[5-8]。D-gal是動物體內(nèi)正常的營養(yǎng)成分，機體在正常情況下將D-gal轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。過量攝入則會引起機體細(xì)胞內(nèi)大量D-gal堆積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激-自由基損害，破壞細(xì)胞線粒體、DNA和蛋白質(zhì)等，進(jìn)而出現(xiàn)器官損傷[9-10]。L-谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機體正常生理活動，但是大量谷氨酸能夠引起神經(jīng)興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元的腫脹、凋亡與壞死，谷氨酸誘導(dǎo)肝損傷未見報道[11-12]。因此，D-半乳糖和L-谷氨酸聯(lián)合作用是增強或降低肝毒性，值得探索。

Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，TLRs家族是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體蛋白，其中TLR2通過刺激觸發(fā)骨髓分化因子88依賴性信號傳導(dǎo)可增強核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活化，激活炎性反應(yīng)[13-17]。研究表明TLR2/NF-κB信號通路在肝損傷中起到重要作用，在肝損傷時二者表達(dá)均升高[18]。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是一種藥物轉(zhuǎn)運體，在肝中主要介導(dǎo)疏水性陽離子的外排，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。有研究發(fā)現(xiàn)P-gp在肝損傷發(fā)生時，表達(dá)上調(diào)[19-20]。

本研究給予樹鼩D-半乳糖和L-谷氨酸，探索復(fù)合因素的實驗性肝損傷動物模型。通過檢測TLR2/NF-κB和P糖蛋白的表達(dá)，初步探究樹鼩肝損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

28只雄性10月齡樹鼩，體重(136 ± 20)g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部【SCXK(滇)K2015-0002】，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)普通級實驗室【SYXK(滇)K2015-0002】。實驗操作符合實驗動物倫理學(xué)要求【倫理審批號：KMMU2019017】。

1.1.2 主要儀器與試劑

組織包埋機(Leica，美國)，切片機(Leica，美國)，攤片烤片一體機(Leica，美國)，生物顯微鏡(Leica，美國)，L-谷氨酸(Sigma，美國)，D-半乳糖(Sigma，美國)，Anti-P Glycoprotein(Abcam，ab170904)，Anti-NF-κB p65(Abcam，ab32536)，Anti-TLR2(Abcam，ab209216)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組、給藥及取材

將28只健康雄性樹鼩隨機分為4組，每組7只。分別為對照組(CT組，灌胃生理鹽水8 mL/kg)、L-谷氨酸組(G組，灌胃2000 mg/kg)、D-半乳糖組(D組，腹腔注射600 mg/kg)、 D-半乳糖聯(lián)合L-谷氨酸組(D+G組，腹腔注射D-半乳糖600 mg/kg；灌胃L-谷氨酸2000 mg/kg)，每天給藥1次，持續(xù)8周。每周稱量動物體重，記錄存活數(shù)。心臟采血處死樹鼩后，4%多聚甲醛灌注固定臟器，取肝組織立刻置于4%多聚甲醛48 h，透明，浸蠟，包埋。

1.2.2 組織學(xué)染色檢測

蠟塊切片，脫蠟。HE染色：蘇木素染色，用水沖洗后鹽酸酒精分化，伊紅染色，脫水封片。免疫組織化學(xué)染色：檸檬酸組織抗原修復(fù)液于高壓鍋里煮2 min，PBS沖洗3次；過氧化氫孵育15 min，PBS沖洗3次；用一抗孵育于4度冰箱過夜，PBS沖洗3次；二抗孵育15 min，PBS沖洗3次；DAB顯色液孵育3 min，顯微鏡觀察顯色后用PBS沖洗終止顯色；蘇木素染色4 min，水沖洗，鹽酸酒精分化6 s，用水返藍(lán)至鏡下觀察細(xì)胞核為藍(lán)色；脫水封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用Image J對樹鼩肝組織免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行處理，計算陽性面積占比及平均光密度值；應(yīng)用Graphpad prism 7對陽性面積占比及平均光密度值作圖并進(jìn)行組間One-way ANOVA法分析，P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 L-谷氨酸與D-半乳糖處理對樹鼩體重和存活率的影響

如圖1A所示，給藥第1周，各組樹鼩平均體重均有所下降。與第1周相比，樹鼩第8周的平均體重均上升的是CT組(13%)、G組(12%)、D組(6%)，而D+G組體重下降6%。如圖1B所示，給藥8周后，CT組的存活率為100%，G組為87.5%，D組為54.55%，D+G組70%。

2.2 L-谷氨酸與D-半乳糖處理對樹鼩肝組織的影響

組織病理學(xué)的結(jié)果顯示，CT組樹鼩肝細(xì)胞索呈放射狀排列，從中央靜脈(central vein，CV)輻射并通過血竇(blood sinusoids，S)，肝細(xì)胞形態(tài)良好(圖2A)。門靜脈(portal vein，PV)區(qū)域有分支膽管(bile ducts， BD)(圖2E)；少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖2I)。G組可見肝細(xì)胞水樣變性，部分細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞水腫(edema，E)，中央靜脈擴張(圖2B)；門靜脈、分支膽管擴張(圖2F)；炎癥細(xì)胞浸潤較明顯(圖2J)。D組肝細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)較模糊，可見核固縮(#)，CV擴張(圖2C)；PV、BD擴張(圖2G)；炎癥細(xì)胞浸潤加重(圖2K)。D+G組損傷更為嚴(yán)重，可見肝細(xì)胞脂肪變性(&)，細(xì)胞核空泡化(*)，細(xì)胞索狀消失，肝血竇明顯增寬，肝細(xì)胞呈游離狀態(tài)、數(shù)量減少，CV擴張(圖2D)；PV和BD擴張明顯(圖2H)；有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(inflammatory cell infiltration，ICI)(圖2L)。

圖1 L-谷氨酸與D-半乳糖對樹鼩體重(A)和存活率(B)的影響Figure 1 Changes of the body weight(A)and survival rate(B)in tree shrews after intervention

注：CT組(AEI),G組(BFJ),D組(CGK),D+G組(DHL);A-D中，CV，S，E，#，&，*分別表示中央靜脈(central vein，CV)，血竇(blood sinusoids，S)，肝細(xì)胞水腫(edema，E)，核固縮(#)，肝細(xì)胞脂肪變性(&)，細(xì)胞核空泡化(*)；E-H中，PV，BD分別表示門靜脈(portal vein，PV)，分支膽管(bile ducts， BD)；I-L中，ICI表示炎癥細(xì)胞浸潤(inflammatory cell infiltration，ICI)。圖2 樹鼩肝組織形態(tài)Note. CT group (AEI), G group(BFJ), D (CGK), D+G grop(DHL). A-D， CV, S, E, #, &, * represent central vein，blood sinusoids, Hepatoedema, Nuclear pyknosis, Cell steatosis, Cell vacuolation. E-H， PV and BD represent portal vein, bile ducts. I-L ICI represent inflammatory cell infiltration.Figure 2 Histological structure in liver tissu

2.3 L-谷氨酸與D-半乳糖處理增加了樹鼩肝Toll樣受體2(TLR2)的表達(dá)

IHC染色顯示，TRL2主要在肝血竇與細(xì)胞膜上表達(dá)(圖3A)。G組(P< 0.05)、D組(P< 0.05)、D+G組(P< 0.05)的TRL2陽性面積占比(圖3B)、平均光密度值均顯著高于對照組(圖3C)。在3個處理組中，D+G組(P< 0.05)的陽性面積占比、平均光密度值均顯著高于G組和D組。

注：A： 各組樹鼩TLR2圖片(IHC染色)。B， C： CT組與G，D，D+G組相比，*P< 0.05，D+G組與G，D組相比，#P < 0.05。圖3 樹鼩肝組織TLR2的表達(dá)Note. A, Immunohistochemical staining of TLR2(IHC staining). B, C, CT group compared with G,D,D+G group,*P< 0.05.D+G group compared with G,D group, #P < 0.05.Figure 3 Expression of TLR2 in liver tissue

2.4 L-谷氨酸與D-半乳糖處理增加了樹鼩肝核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達(dá)

NF-κB主要表達(dá)定位于肝血竇膜上。L-谷氨酸、D-半乳糖及L-谷氨酸聯(lián)合D-半乳糖均能增加肝NF-κB表達(dá)(圖4A)。G組、D組、D+G組NF-κB的陽性面積占比(圖4B)、平均光密度值均極顯著高于對照組(圖4C)(P< 0.01)。相對于G組和D組，D+G組的陽性面積占比、平均光密度值均顯著升高(P< 0.01)。

注：A： 各組樹鼩NF-κB圖片(IHC染色)。B，C： CT組與G，D，D+G組相比，**P< 0.01；D+G組與G，D組相比，##P< 0.01。圖4 樹鼩肝組織NF-κB的表達(dá)Note. A, Immunohistochemical staining of NF-κB(IHC staining). B, C, CT group compared with G,D,D+G group,*P< 0.01.D+G group compared with G,D group, ##P< 0.01.Figure 4 Expression of NF-κB in liver tissue

2.5 L-谷氨酸與D-半乳糖處理增加了樹鼩肝P-糖蛋白(P-gp)的表達(dá)

免疫組化表明樹鼩肝P-gp表達(dá)主要在細(xì)胞核與細(xì)胞膜上(圖5A)。與CT組比較，G組、D組、D+G組P-gp的陽性面積占比(圖5B)、平均光密度值均及顯著升高(P< 0.01)(圖5C)。D+G組的陽性面積、平均光密度值極顯著高于G、D組(P< 0.01)。提示L-谷氨酸、D-半乳糖及L-谷氨酸聯(lián)合D-半乳糖均能引起肝P-糖蛋白表達(dá)增加，以介導(dǎo)藥物外排，其中L-谷氨酸聯(lián)合D-半乳糖的藥物外排作用顯著高于單獨給藥。

注：A：各組樹鼩P-gp圖片(IHC染色)。B，C： CT組與G，D，D+G組相比，**P< 0.01；D+G組與G，D組相比，##P< 0.01。圖5 樹鼩肝組織P-gp的表達(dá)Note. A, Immunohistochemical staining of P-gp(IHC staining). B, C, CT group compared with G,D,D+G group,**P< 0.01.D+G group compared with G,D group, ##P< 0.01.Figure 5 Expression of P-gp in liver tissue

3 討論

本實驗探究D-半乳糖和L-谷氨酸對樹鼩肝的損傷情況。有研究表明長期大劑量給予D-半乳糖、谷氨酸均能夠?qū)C體產(chǎn)生損傷[21-22]。體重與存活率能反映機體的綜合代謝，進(jìn)而反應(yīng)藥物對機體的治療和損傷作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，D+G組樹鼩體重減輕，存活率下降，提示L-谷氨酸與D-半乳糖聯(lián)合給藥，對樹鼩有明顯的損傷作用。肝是機體的主要代謝器官，也是化學(xué)物質(zhì)最重要的靶器官，肝損傷是一種多因素疾病。肝損傷的主要靶細(xì)胞為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，其病理特點復(fù)雜多變。肝活檢是臨床上判斷肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，協(xié)助分析病因和判斷預(yù)后[23]。D-半乳糖能夠?qū)е滦∈蟾谓M織細(xì)胞排列不整齊，肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)明顯病變[24-27]。谷氨酸鈉導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)腫脹，細(xì)胞核空泡化，門靜脈區(qū)域充血，膽管擴張和炎性細(xì)胞浸潤[28-30]。本實驗顯示L-谷氨酸對樹鼩肝細(xì)胞損傷與谷氨酸鈉類似。此外，D-半乳糖聯(lián)合L-谷氨酸給藥，肝組織病理損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞核空泡化，細(xì)胞索狀消失，肝血竇明顯增寬，中央靜脈與門靜脈擴張明顯，有大量的炎癥細(xì)胞浸潤。提示聯(lián)合給藥導(dǎo)致樹鼩肝組織較強炎性反應(yīng)。

Toll樣受體的胞內(nèi)段與IL-1受體同源，其激活能激發(fā)早期抗感染的炎性細(xì)胞因子生成，進(jìn)而啟動機體炎性防御機制。TLRS及其信號途徑在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，通過參與炎性細(xì)胞因子的表達(dá)而參與多種疾病過程。TLRS的激活引起下游分子活化，導(dǎo)致NF-κB的活化及啟動子結(jié)合蛋白磷酸化，誘導(dǎo)NF-κB信號通路的促炎性因子反應(yīng)，激活炎性因子產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。張昭[31]發(fā)現(xiàn)急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)肝中TLRs與NF-κB具有正相關(guān)性，TLRs表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步激活NF-κB，炎性介質(zhì)表達(dá)增強，肝損傷加重。TLR2是TRLs家族中研究最早分布最廣泛的成員，受到內(nèi)外源性配體刺激后，通過骨髓分化因子88依賴性途徑活化NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)促炎因子和炎性因子表達(dá)[32]。四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝損傷中，TLR2與NF-κB表達(dá)顯著升高[33]。在AHNP肝損傷模型中大鼠，TLR2mRNA和TLR2的表達(dá)均顯著升高[34-36]。糖尿小鼠病伴有肝損傷時NF-κB的表達(dá)顯著上升[37]。與以上報道相似，本實驗顯示D-半乳糖、L-谷氨酸及二者聯(lián)合給藥均使TLR2、NF-κB的表達(dá)升高。推測D-半乳糖、L-谷氨酸通過刺激TLR2/NF-κB信號通路，促發(fā)炎性反應(yīng)，引起肝組織病理改變。

糖蛋白也稱為多耐藥基因1，是ABC結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，依賴ATP供能，介導(dǎo)肝細(xì)胞外排藥物[38-39]。主要介導(dǎo)疏水性陽離子外排降低肝細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。炎性反應(yīng)等病理條件下藥物轉(zhuǎn)運體的活性和表達(dá)改變，進(jìn)而影響療效或產(chǎn)生毒性。臨床病理條件下，肝藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)的改變反映病情進(jìn)程[40]。P-糖蛋白在慢性肝損傷中發(fā)揮一定作用[41]。周利婷等[19]在異煙肼致小鼠肝損傷中觀察到P-糖蛋白升高。李春桃[20]在小鼠肝癌模型中發(fā)現(xiàn)，肝缺血再灌注損傷時，P-糖蛋白顯著升高。本實驗中L-谷氨酸、D-半乳糖單獨或聯(lián)合給藥，均引起樹鼩肝P-糖蛋白的高表達(dá)，當(dāng)二者聯(lián)合給藥時P-糖蛋白的表達(dá)最高。提示炎癥反應(yīng)嚴(yán)重性與P-糖蛋白增加正相關(guān)。

綜上所述，D-半乳糖、L-谷氨酸單獨或聯(lián)合作用均可引起樹鼩肝組織損傷，其中聯(lián)合給藥損傷較嚴(yán)重。其機制可能涉及TLR2/NF-κB通路激活而誘發(fā)炎性反應(yīng)；同時樹鼩肝組織P-糖蛋白代償性增加，以緩解毒性。