地鱉肽對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠的抗氧化保護作用的研究

劉丹，曹碩，劉陽，劉杰，王朕，張永紅,2*，沈紅,2*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動物類國家級實驗教學(xué)示范中心，北京 102206；2. 北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

肝是機體重要代謝器官，對機體內(nèi)去氧化、肝糖儲存、分泌蛋白等起重要作用，其還擔(dān)負(fù)機體解毒、消化等重要的生理功能[1-2]。肝損傷多是由體內(nèi)產(chǎn)生自由基過多，過氧化導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為食欲減退、體重減輕、腹脹等[3]。肝疾病是嚴(yán)重危害機體健康的疾病之一，其最常見致病因素如病毒、細(xì)菌、藥物、酒精、缺血、肝部分切除等，造成肝細(xì)胞的一系列病變，及慢性肝損傷[4-5]。四氯化碳(CCl4)對動物肝具有強烈的毒性，引起肝組織脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和壞死,甚至肝纖維化，CCl4常用于建立動物慢性肝損傷模型[6]。中醫(yī)藥古籍記載地鱉(EupolyphagasinensisWalker，ESW)具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、接骨續(xù)筋等功效[7]?，F(xiàn)代技術(shù)分析地鱉有多種有效成分，主要有蛋白質(zhì)、維生素、礦物元素、多糖、生物堿等[8]。研究表明，地鱉有效提取成分之一地鱉肽具有明顯清除自由基，抗氧化和抗衰老等作用[9]。研究表明，采用酶解蛋白獲得多肽及生物技術(shù)提取小分子肽清除自由基能力強[10]。本研究基于前期研究成果地鱉肽抗氧化作用，擬通過四氯化碳誘導(dǎo)小鼠建立慢性肝損傷模型，探討地鱉肽對肝損傷小鼠的抗氧化保護作用及其機制，為其開發(fā)作為抗氧化劑提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6 ～ 8周齡健康昆明小鼠，體重20 ～ 22 g，清潔級，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK(京)2016-0002】。飼養(yǎng)和無菌手術(shù)均在北京農(nóng)學(xué)院實驗動物示范中心屏障動物實驗設(shè)施進(jìn)行【SYXK (京)2015-0004】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。小鼠飼養(yǎng)期間自由飲水，飼喂由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供的普通維持飼料，溫度和濕度恒定，飼養(yǎng)符合實驗動物要求。

1.1.2 試劑與儀器

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物有限公司，HiFi-MMLV cDNA Kit購自康為試劑生物科技有限公司，小鼠TNF-α、IL-6和iNOS ELISA試劑盒購自Elabscier公司，四氯化碳(CCl4)、地鱉肽ESW peptides由本實驗室制備；所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

UV-3紫外可見分光光度(上海美普達(dá)有限公司)，低溫高速離心機(Eppendorf公司)，超低溫冰箱(日本SANYOO公司)，NanoDrop2000核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific)，S1000 Theral Cycler梯度PCR儀(Bio-Rad)，CFX Connect 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

取小鼠隨機分為正常組(Control group，C)、模型組(Model group，M)、陽性藥組(Positive group，P)、地鱉肽(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)組。除正常組外其余所有小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液10 mL/kg，每周2次連續(xù)6周；地鱉肽組小鼠分別灌服不同劑量地鱉肽，陽性藥組小鼠灌服水飛薊素100 mg/kg，模型組和正常組小鼠灌服生理鹽水10 mL/kg，每天1次連續(xù)6周。

1.2.2 一般指標(biāo)觀察及臟器指數(shù)

肉眼觀察小鼠的一般情況，每周稱重并記錄。末次給藥24 h后，眼球采血，制備血清備用。頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取肝脾稱重，按公式計算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.2.3 小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的觀察

取小鼠肝右葉、用4%多聚甲醛溶液浸泡固定、制作肝組織切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化，拍照。

1.2.4 肝功能酶和指標(biāo)抗氧化酶活性和MDA含量炎癥因子蛋白水平檢測

取待測血清，按照試劑盒說明測定肝功能酶(ALT、AST)活性；稱取小鼠肝左葉0.2 g，生理鹽水清洗，勻漿制備10%肝勻漿，按照試劑盒說明書操作測定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活性和MDA含量，炎癥因子(IL-6、TNF-α、iNOS)含量。

1.2.5 肝組織炎癥凋亡及纖維化因子基因表達(dá)的檢測

采用TRIzon提取小鼠肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR儀實時定量擴增，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)IL-6、TNF-α、iNOS、Bax、Bcl-2、Caspase-3、α-SMA、TGF-β1引物，Tm值進(jìn)行分析，SDS軟件分析數(shù)據(jù)，比較Ct值分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化分析

整個試驗過程中正常組小鼠生長狀況良好；模型組小鼠隨著CCl4灌服出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、大便稀溏等現(xiàn)象；陽性藥組和地鱉肽組小鼠狀態(tài)較模型組明顯有所改善，毛色有光澤。肉眼觀察肝組織，結(jié)果正常組小鼠肝顏色呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)地柔軟；模型組小鼠肝顏色發(fā)黯，質(zhì)地松軟；陽性藥物組和地鱉肽組與模型組比較小鼠肝損傷均有所減輕，高劑量地鱉肽組小鼠肝外觀接近對照組(圖1)。

顯微鏡觀察正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，中央靜脈血管壁清晰可見；模型組小鼠肝組織肝細(xì)胞索排列紊亂、腫脹變性，中央靜脈管腔內(nèi)有淤血，炎性細(xì)胞浸潤，纖維增生；地鱉肽組隨著地鱉肽劑量增加小鼠肝細(xì)胞變性和壞死程度減輕，中高劑量組改善較為明顯(圖2)。模型組小鼠的肝脾指數(shù)均顯著高于正常組，地鱉肽組和陽性藥組小鼠肝脾指數(shù)均顯著低于模型組(圖3)。

注：C，正常組；M，模型組；P，陽性藥物組。與正常對照組相比，**P< 0.01；與模型組相比，△P< 0.05,△△P< 0.01。(下圖同)圖3 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響Note. C，Control group. M, Model group. P, Positive group. Compared with the control group,**P < 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05,△△P< 0.01.(The same in the following figures)Figure 3 Effect of ESW peptides on organ index in mice with chronic liver injury

2.2 地鱉肽對CCl4慢性肝損傷小鼠肝功能的影響

模型組小鼠肝功能指標(biāo)(ALT、AST)酶活力明顯高于正常組，地鱉肽組和陽性藥組ALT和AST酶活力較模型組顯著下降(圖4)；模型組小鼠肝組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力比正常組顯著降低，而過氧化物(MDA)含量顯著升高，陽性藥組和地鱉肽組抗氧化酶(SOD、CAT、GS H-Px)活力均顯著高于模型組，地鱉肽組MDA 含量均顯著降低(圖5)。

圖4 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝功能的影響Figure 4 Effects of ESW peptides on the liver function in mice with chronic liver injury

圖5 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中抗氧化酶活力和MDA含量的影響Figure 5 Effects of ESW peptides on the activities of antioxidant enzymes and MDA content in liver tissue of mice with chronic liver injury

2.3 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中炎癥因子蛋白及基因表達(dá)的影響

分析肝損傷小鼠肝組織中炎癥細(xì)胞水平，結(jié)果模型組小鼠肝組織中炎癥因子(TNF-α、IL-6、iNOS)蛋白表達(dá)量均顯著高于正常組，地鱉肽組炎癥因子蛋白水平均顯著降低且低于模型組，接近陽性藥組，表達(dá)水平與地鱉肽給藥劑量呈正相關(guān)(圖6)。采用熒光定量PCR分析小鼠肝組織中炎癥因子基因表達(dá)，結(jié)果模型組炎癥因子(IL-6、TNF-α、iNOS)基因表達(dá)量高于正常組，地鱉肽組和水飛薊素藥物組較模型組下降，中高劑量組下降極顯著接近陽性藥組(圖7)。

2.4 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中凋亡及纖維化因子基因表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組促凋亡因子(Bax、Caspase-3)mRNA水平均高顯著升高，陽性藥組和地鱉肽組均顯著低于模型組降低，且與地鱉肽劑量呈正相關(guān)；與模型組相比較，陽性藥組和地鱉肽組抑制凋亡因子Bcl-2表達(dá)量顯著升高而促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表達(dá)顯著降低(圖8)。與正常組相比，模型組纖維化因子(α-SMA、TGF-β1)mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，陽性藥組和地鱉肽組纖維化因子均顯著低于模型組(圖9)。

圖6 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中炎癥因子蛋白水平的影響Figure 6 Effects of ESW peptides on the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice with chronic liver injury

圖7 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中炎癥因子基因表達(dá)的影響Figure 7 Effects of ESW peptides on gene expressions of inflammatory factors in the liver tissues of mice with chronic liver injury

圖8 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠的肝組織中凋亡因子基因表達(dá)的影響Figure 8 Effects of ESW peptides on the gene expression of apoptotic factor in the liver tissues of mice with chronic liver injury

圖9 地鱉肽對慢性肝損傷小鼠肝組織中纖維化因子基因表達(dá)的影響Figure 9 Effects of ESW peptides the gene expression of fibrosis factor in the liver tissues of mice with chronic liver injury

3 討論

四氯化碳(CCl4)為肝毒性化學(xué)物，臨床上人長期反復(fù)接觸CCl4會有頭暈、乏力、失眠、記憶力減退、食欲不振、惡心、腹瀉和腹痛等，出現(xiàn)肝腫大和肝功能異常，嚴(yán)重發(fā)展成門脈性肝硬化，連續(xù)給予CCl4可使肝細(xì)胞變性、壞死、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，水飛薊素為目前公認(rèn)的抗肝損傷有效藥物，動物實驗常將該藥作為肝損傷保護的陽性對照用藥[11-12]。本研究顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果CCl4致小鼠肝組織肝細(xì)胞索排列紊亂、腫脹變性，中央靜脈管腔內(nèi)有淤血，炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生，隨著地鱉肽劑量增加小鼠肝細(xì)胞變性和壞死程度減輕，結(jié)果與前人報道一致。CCl4進(jìn)入機體后激活肝藥酶P-450，促進(jìn)機體生產(chǎn)過量自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，導(dǎo)致肝細(xì)胞中ALT、AST釋放，使血中ALT、AST升高[13]。劉竹青等[14]用D-半乳糖建立致衰老小鼠模型，測定黃粉蟲酶解物體內(nèi)抗氧化能力，結(jié)果黃粉蟲酶解物可顯著提高小鼠血漿、肝中 CAT、GSH-Px、T-SOD活力，降低 MDA含量。劉雪姣[15]研究玉米低聚肽對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷保護作用，結(jié)果玉米低聚肽能降低AST、ALT活力和MDA含量,在一定程度上提高SOD和GSH-Px活力等，達(dá)到預(yù)防四氯化碳所致小鼠急性肝損傷，且明顯改善小鼠肝功能狀況。李諺語等[16]研究保肝湯對四氯化碳(CCl4)致慢性化學(xué)性肝損傷的保護作用，結(jié)果保肝湯高、中、低劑量組ALT、AST水平降低,保肝湯中、低劑量組MDA含量顯著降低。CCl4的毒性作用會造成肝組織局灶性的壞死，損傷肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，使其釋放α-SMA、TGF-β1、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子引發(fā)炎性反應(yīng)[17]。郭心怡[18]采用芍藥苷干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷，結(jié)果芍藥苷明顯降低四氯化碳誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)，肝組織α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著下降。Wang等[19]研究球姜酮通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來保護小鼠四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，結(jié)果球姜酮可以恢復(fù)SOD和GSH-Px的活性，減少MDA的產(chǎn)生，并減少促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的釋放量。袁靜等[20]探討山丹黃參多糖對四氯化碳(CCl4)小鼠肝損傷的保護作用,結(jié)果藥物組血漿ALT、AST、活性明顯降低,肝組織SOD活力顯著升高,MDA含量明顯下降，Caspase-3及Bax蛋白陽性表達(dá)明顯減少。本研究結(jié)果地鱉肽明顯降低CCl4致慢性肝損傷小鼠血清中肝功能指標(biāo)(ALT、AST)，顯著提高肝組織中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性，明顯抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物(MDA)生成，降低肝細(xì)胞炎癥因子(IL-6、TNF-α、iNOS)、促凋亡因子(Bax、Caspase-3)、纖維化因子(α-SMA、TGF-β1)產(chǎn)生，以上試驗結(jié)果與有關(guān)研究報道基本一致。

綜上所述，地鱉肽對CCl4導(dǎo)致的小鼠慢性肝損傷有一定的抗氧化保護作用，其保護作用機理可能是通過提高肝抗氧化酶活力，抑制脂質(zhì)過氧化，降低炎癥因子及凋亡因子生成，維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。