低氧訓(xùn)練對肥胖小鼠Ghrelin-GHSR通路的影響

龔麗景，付鵬宇，朱镕鑫，張一民,4，許春艷*

(1. 北京體育大學(xué)中國運(yùn)動(dòng)與健康研究院，北京 100084； 2. 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3. 上海體育科學(xué)研究所，上海 200030； 4. 運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

低氧訓(xùn)練是指持續(xù)或間歇在低于正常氧氣濃度的環(huán)境下(高原地區(qū)或人工模擬低氧艙)進(jìn)行訓(xùn)練，利用低氧和訓(xùn)練的雙重缺氧刺激以更多地調(diào)動(dòng)機(jī)體潛能，是提高運(yùn)動(dòng)能力的有效訓(xùn)練方法[1]。隨著全民健身觀念的普及，低氧訓(xùn)練也逐步被引入大眾健康領(lǐng)域。多項(xiàng)研究證明低氧訓(xùn)練具有較好的糖脂代謝的調(diào)控功能，低氧環(huán)境會(huì)減弱食欲，降低消耗吸收功能，從而減少攝食量[2]，這些認(rèn)知使低氧訓(xùn)練被認(rèn)為是減肥的有效手段。

生長激素(growth hormone，GH)促分泌受體的內(nèi)源性配體——胃促生長素/胃饑餓素(Ghrelin)發(fā)揮作用依賴于下丘腦分泌的生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)[3]。Ghrelin在Ghrelin-O乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ghrelin O-acyltransferase，GOAT)的作用下?；瞧渑c受體GHSR結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的前提[4]。Ghrelin及相關(guān)通路不僅可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)發(fā)揮促食欲功效[5]，還調(diào)控能量平衡并參與調(diào)控中樞和外周的脂質(zhì)代謝[6]。低氧環(huán)境下低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)被激活參與機(jī)體的適應(yīng)性應(yīng)答，其中HIF-2α與脂代謝密切相關(guān)[7]。那么低氧訓(xùn)練發(fā)揮減脂控重的作用是否通過調(diào)控胃組織Ghrelin-GHSR通路發(fā)揮作用尚無研究，因此本研究擬通過對肥胖小鼠施加低氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察胃組織Ghrelin-GHSR通路相關(guān)基因改變，以探究低氧訓(xùn)練發(fā)揮減肥作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級雄性C57BL/6J小鼠，3周齡，體重為(8.2 ± 0.1)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，【SCXK(京)2015-0004】，飼養(yǎng)期間各組小鼠均自由攝食飲水；普通維持飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(軍)2012-0004】提供；高脂飼料購于美國Research Diet(D12109C，含40% kcal脂肪)。小鼠于北京體育大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2016-0033】飼養(yǎng)：晝夜12/12 h，濕度恒定，溫度控制在22 ～ 25℃。本研究經(jīng)北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：IACUC 2015021)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Anti-GHSR(Abcam ab95250)、Anti-Ghrelin(Abcam ab129383)、Anti-GOAT(Abcam ab170690)、Anti-NPY(Santa Cruz，sc-14728-R)、HIF-2α(Abcam ab109616)、anti-Tubulin(博奧森 bs-4511R)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Goat Anti-rabbit IgG/HRP，博奧森 bs-0295G-HRP)，SuperSignalTMWest Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific, 34095)，Rat/mouse Ghrelin(Total) ELISA Kits(Merck EZRGRT-91 K)，MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa 9767)，PrimeScriptTMMaster Mix(TaKaRa RR036A)，SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa RR820A)。

1.1.3 儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500，美國)，動(dòng)物跑臺(tái)(杭州段氏DSPT-215，中國)，制氮機(jī)(北京創(chuàng)文，中國)，空氣壓縮機(jī)(英格索蘭，美國)，全自動(dòng)生化分析儀(日立7020，日本)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 680，美國), 超微量分光光度儀(NanoDrop 2000，美國)，蛋白轉(zhuǎn)印儀(Thermo Scientific iBlot 2，美國)，ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

小鼠隨機(jī)分為普通膳食對照組(C，n=8，飼喂普通維持飼料)和高脂膳食組(H，n=52，飼喂高脂飼料)。8周后，選擇H組大于C組平均體重的20%作為肥胖模型，隨機(jī)分為：肥胖對照組(HC，n=8)、肥胖常氧運(yùn)動(dòng)組(HE，n=8)、肥胖低氧暴露組(HH，n=8)和肥胖低氧運(yùn)動(dòng)組(HHE，n=8)，繼續(xù)飼喂高脂飼料。HE和HHE組進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，速度12 m/min，1 h/d。HH和HHE組暴露在11.2%的低氧房中，8 h/d；其中HHE組每天固定時(shí)間在低氧環(huán)境中運(yùn)動(dòng)1 h，6次/周。干預(yù)共4周。

1.2.2 形態(tài)指標(biāo)測試及取材

每周記錄體重和攝食量。完成訓(xùn)練后禁食12 h，腹腔麻醉(1%的戊巴比妥鈉，40 mg/kg體重)，心臟取血，收集血清，-20℃保存。開腹取胃底部和開顱取下丘腦組織，分別置于RNA保存液和-80℃保存，分別用于RNA和蛋白含量的測試。

1.2.3 血液生化指標(biāo)和總Ghrelin水平測試

采用全自動(dòng)生化分析儀測試血液甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和血糖(glucose，GLU)水平。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測試血清總Ghrelin水平。

1.2.4 下丘腦GHSR和胃組織Ghrelin mRNA相對含量測定

使用試劑盒提取胃和下丘腦總RNA，檢測總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后，按說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。Ghrelin和GHSR引物參考付鵬宇等[8]，由生工生物工程(上海)有限公司合成。18S為內(nèi)參基因(德國QIAGEN QT01036875)。采用比較閾值法(△△Ct法)對目的基因的相對表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.5 下丘腦GHSR、NPY和胃組織Ghrelin、Goat、HIF-2α蛋白水平測定

提取下丘腦和胃組織總蛋白質(zhì)，BCA法定量總蛋白質(zhì)濃度，用蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測各蛋白的表達(dá)情況。電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至NC膜，BSA封閉1 h，分別4℃孵育一抗過夜，洗去未結(jié)合的一抗，室溫孵育二抗1 h，洗去未結(jié)合的二抗，滴加化學(xué)發(fā)光HRP底物，立即用ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)(Bio-Rad)曝光條帶，使用Image Lab軟件進(jìn)行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)期間小鼠體重和攝食量變化

各組小鼠初始體重平均值為(8.2 ± 0.1)g，飼喂8周高脂飼料后，將H組體重大于C組平均體重20%的小鼠隨機(jī)分成HC組、HE組、HH組和HHE組，未達(dá)標(biāo)小鼠棄去。此時(shí)，HC組、HE組、HH組和HHE組小鼠體重極顯著高于C組(P< 0.01)；干預(yù)4周(飼喂12周)，HC組顯著高于C組，HH、HE和HHE組較HC組顯著下降(P< 0.05)。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，C組飼喂普通維持飼料，H組持續(xù)飼喂高脂飼料。建立肥胖模型期間(8周前)，C組小鼠攝食總量較H組少；飼喂第10周時(shí)(干預(yù)2周)，C組攝食量仍低于高脂膳食各組，HE、HH和HHE組較HC組降低；飼喂第12周時(shí)(干預(yù)4周)，C組攝食量高于高脂膳食各組，HE、HH和HHE組與HC組攝食量接近，見圖1。

2.2 各組小鼠血清TG、TC、GLU和總Ghrelin水平

4周干預(yù)完成后，HC組各項(xiàng)血液指標(biāo)均顯著高于C組(P< 0.05)；與HC組相比，HE組血清TG、TC水平無顯著性差異，但GLU水平顯著性降低(P< 0.05)；HH組血清TC和GLU水平顯著低于HC組，且TC水平顯著低于HE組(P< 0.05)；HHE組血清TG水平較HC組無顯著性差異，TC水平顯著低于HE組，GLU水平顯著低于HC和HE組(P<0.05)。HH組和HHE組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)無顯著差異。4周干預(yù)后，HC組血清總Ghrelin水平較C組無顯著性差異；HE組較HC組無顯著性差異；HH和HHE組小鼠血清總Ghrelin含量較HC組均出現(xiàn)顯著性上升，且HHE組較HE組顯著性上升(P< 0.05)，見表1。

注：C，普通膳食對照組；HC，肥胖對照組；HE，肥胖常氧運(yùn)動(dòng)組；HH，肥胖低氧暴露組；HHE，肥胖低氧運(yùn)動(dòng)組。下表/圖同。與C組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與HC組相比，#P < 0.05。圖1 小鼠體重和攝食量變化Note. C, the control group. HC, obese control group.HE, obese exercise group.HH, obese hypoxic exposure group. HHE, obese hypoxic exercise group. The same in the following table and figures. Compared with C group,*P < 0.05,**P < 0.01. Compared with HC group,#P < 0.05.Figure 1 Changes in body weight and food intake in mice

表1 各組小鼠血清TG、TC、GLU和總Ghrelin水平(n=8)
Table 1 Levels of serum TG, TC, GLU and total Ghrelin in each group of mice(n=8)

組別GroupsTG (mg/dL)TC (mmol/L)GLU (mmol/L)Ghrelin (mmol/L)C0.29 ± 0.022.03 ± 0.098.50 ± 0.780.31 ± 0.09HC 0.34 ± 0.03*4.54 ± 0.03*10.22 ± 1.77*0.30 ± 0.06HE0.33 ± 0.044.66 ± 0.11 8.25 ± 1.33#0.32 ± 0.11HH0.35 ± 0.07 3.98 ± 0.30#△ 8.06 ± 1.29# 0.36 ± 0.15#HHE0.33 ± 0.08 4.24 ± 0.26△ 6.38 ± 1.72#△ 0.40 ± 0.21#△

注：與C組相比，*P< 0.05；與HC組相比，#P< 0.05；與HE組相比，△P< 0.05。

Note. Compared with C group,*P< 0.05. Compared with HC group,#P< 0.05. Compared with HE group,△P< 0.05.

2.3 下丘腦GHSR和胃組織Ghrelin mRNA的表達(dá)水平

與C組相比，12周高脂喂養(yǎng)后，HC組下丘腦GHSR和胃組織Ghrelin mRNA表達(dá)水平均極顯著降低(P< 0.01)；4周干預(yù)后，HE和HH組下丘腦GHSR mRNA表達(dá)水平較HC組有增加趨勢，但無顯著差異，但HE和HH組胃組織Ghrelin mRNA表達(dá)水平較HC組顯著性升高(P< 0.01或P< 0.05)；HHE組下丘腦GHSR mRNA表達(dá)水平較HC組顯著上升，胃組織Ghrelin mRNA表達(dá)水平較HC組極顯著性增加，較HE組也顯著性增加(P< 0.05或P< 0.01)，見圖2。

注：與C組相比，**P< 0.01；與HC組相比，#P < 0.05，##P < 0.01；與HE組相比，△P < 0.05。圖2 小鼠下丘腦GHSR和胃組織Ghrelin mRNA表達(dá)水平Note. Compared with C group,**P < 0.01. Compared with HC group,#P < 0.05,##P < 0.01. Compared with HE group,△P < 0.05.Figure 2 GHSR mRNA expression in hypothalamic tissues and Ghrelin mRNA expression in gastric tissues of mice

2.4 下丘腦和胃組織的蛋白表達(dá)水平

12周高脂飼料喂養(yǎng)后，HC組下丘腦GHSR和NPY的蛋白表達(dá)水平較C組無顯著性差異；HE、HH和HHE組下丘腦GHSR蛋白表達(dá)水平較HC組顯著增加(P< 0.05)；HE和HHE組下丘腦NPY蛋白表達(dá)水平較HC組顯著上調(diào)(P< 0.05)(見圖3 A，B)。高脂飼喂后，HC組胃組織Ghrelin、Goat和HIF-2α的蛋白表達(dá)水平與C組相比無顯著差異；HE組胃組織Ghrelin、Goat較HC組顯著增加(P< 0.05)；HH組胃組織Ghrelin和HIF-2α的蛋白表達(dá)水平較HC組顯著增加(P< 0.05)；HHE組胃組織Ghrelin、Goat和HIF-2α的蛋白表達(dá)水平較HC組顯著增加，且HIF-2α蛋白表達(dá)水平顯著高于HE組(P< 0.05)(見圖3C，D)。

注：與HC組相比，#P < 0.05；與HE組相比，△P < 0.05。圖3 下丘腦和胃組織相關(guān)蛋白WB條帶灰度值(A，C)和相對含量(B，D)Note. Compared with HC group,#P < 0.05. Compared with HE group,△P < 0.05.Figure 3 WB results (A, C) and relative amounts (B, D) of hypothalamic and gastric tissue-associated proteins of mice

3 討論

Ghrelin是由胃底粘膜腺中的X/A樣細(xì)胞合成和分泌的28個(gè)氨基酸的活性肽激素，是調(diào)節(jié)食欲的重要激素[3]。近年來，Ghrelin被認(rèn)為具有對抗肥胖的潛能并開始引起廣泛關(guān)注[6]。

研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)中Ghrelin含量與體重成反比[9]。肥胖機(jī)體下丘腦和胃組織中的Ghrelin水平會(huì)出現(xiàn)下降[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠胃組織Ghrelin和下丘腦GHSR mRNA水平出現(xiàn)顯著性下降，血脂和血糖(TG、TC和GLU)水平上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可依賴GHSR發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝的作用，Ghrelin-GHSR通路可通過促進(jìn)5’-磷酸腺苷蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)磷酸化，以激活A(yù)MPK，使乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)磷酸化失活，減少丙二酰-CoA(malonyl-CoA)的積累，導(dǎo)致肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)活性增加以促進(jìn)脂肪酸氧化[12]。Ghrelin刺激NPY神經(jīng)元可阻斷黑色素皮質(zhì)素受體3和4(melanocortin receptor 3/4，MC3/4R)，隨后通過交感神經(jīng)調(diào)節(jié)肝臟、白色脂肪組織、棕色脂肪組織和骨骼肌組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)以影響外周脂代謝水平[13-14]。此外，Ghrelin還是葡萄糖代謝的中介物，并可調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞分泌胰島素[15]。推測Ghrelin-GHSR通路在調(diào)控糖脂代謝方面發(fā)揮著重要的作用，然而肥胖機(jī)體組織Ghrelin-GHSR通路表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)糖脂代謝紊亂，血糖血脂水平失調(diào)[16]，從而加劇對機(jī)體的危害[17]。

低氧暴露下體重的丟失常被認(rèn)為與攝食量下調(diào)所致[2, 18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧暴露的最初階段，低氧組(HH和HHE組)小鼠攝食量較常氧組(H和HE組)均出現(xiàn)顯著下降，但隨著低氧暴露時(shí)間延長，低氧組小鼠攝食量逐漸回升，在4周干預(yù)結(jié)束時(shí)，與常氧組接近。機(jī)體攝食功能對長期低氧暴露的適應(yīng)可能與Ghrelin-GHSR的調(diào)控有關(guān)。Ghrelin發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲的作用是通過生長激素促分泌受體GHSR所介導(dǎo)的，GHSR高表達(dá)于下丘腦中調(diào)節(jié)攝食和體重平衡的細(xì)胞群中，如弓狀核NPY神經(jīng)元和腹內(nèi)側(cè)核的脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)神經(jīng)元[19]。而NPY神經(jīng)元發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲的作用由Ghrelin特異性介導(dǎo)的，其他促食欲激素如黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)和前原食欲素(prepro-orexins)則無此作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)急性低氧暴露(12 h)會(huì)導(dǎo)致大鼠胃組織Ghrelin mRNA和蛋白水平極具下調(diào)，但隨著暴露時(shí)間的延長(24 h和48 h)，Ghrelin水平逐漸回升，甚至超過常氧水平[8]。本研究中，低氧訓(xùn)練組小鼠血清Ghrelin總量、胃組織中Ghrelin和Goat及下丘腦GHSR和NPY蛋白表達(dá)水平顯著上升，這可能與Ghrelin-GHSR通路被激活以抵抗低氧的進(jìn)一步損傷和參與前期胃組織損傷的修復(fù)有關(guān)[20]。而常氧運(yùn)動(dòng)小鼠Ghrelin和NPY蛋白水平雖增加但其攝食量未明顯改變，可能與運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)熱增加導(dǎo)致體溫上升，從而抑制了食欲有關(guān)[21]。

本研究中低氧訓(xùn)練干預(yù)后，肥胖小鼠血清TC和GLU水平顯著下降，并伴隨著血液總Ghrelin水平的上調(diào)和胃組織中Ghrelin-GHSR通路相關(guān)基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的增加。這可能與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對Ghrelin-GHSR通路的調(diào)控有關(guān)。由于Ghrelin和運(yùn)動(dòng)均可發(fā)揮促進(jìn)能量代謝平衡的作用，因此兩者間的相互影響作用引起了學(xué)者們的關(guān)注[22]。研究發(fā)現(xiàn)，93 d的騎行運(yùn)動(dòng)后，健康成年男性空腹血液Ghrelin水平增加26%，且體重降低6%[23]。同時(shí)，胰島素抵抗和高胰島素血癥程度與血液Ghrelin水平呈負(fù)相關(guān)，這可能是運(yùn)動(dòng)促進(jìn)糖脂代謝平衡的重要機(jī)制[24]。游泳訓(xùn)練可增加胃組織中Ghrelin表達(dá)，從而降低肥胖大鼠體重和內(nèi)臟脂肪含量[10]。此外，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高胃組織Ghrelin表達(dá)還具有促進(jìn)胃的排空和腸道的推進(jìn)力的作用[25]，從而有助于代謝廢物的排出和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[26]。運(yùn)動(dòng)發(fā)揮促進(jìn)Ghrelin-GHSR通路的表達(dá)可能與交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)，運(yùn)動(dòng)激活交感神經(jīng)和循環(huán)系統(tǒng)中腎上腺素和去甲腎上腺素(兒茶酚胺)的水平，同時(shí)胃組織中產(chǎn)生Ghrelin的細(xì)胞具有α1和β1腎上腺素能受體，而腎上腺素和去甲腎上腺素可刺激β1以促進(jìn)胃組織分泌Ghrelin[27-28]。通過本研究結(jié)果還可觀察到低氧運(yùn)動(dòng)調(diào)控肥胖機(jī)體糖脂代謝的作用優(yōu)于常氧訓(xùn)練，這可能與低氧環(huán)境所激活的HIF-2α調(diào)控作用有關(guān)。本研究結(jié)果中低氧訓(xùn)練后肥胖小鼠下丘腦HIF-2α的蛋白表達(dá)水平顯著增加。HIF是機(jī)體缺氧條件下參與組織細(xì)胞低氧應(yīng)答敏感性轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)是機(jī)體適應(yīng)低氧的起始步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中HIF-2α在脂代謝中發(fā)揮重要的作用，可參與脂滴的形成、脂肪酸的合成和β-氧化及膽固醇代謝的調(diào)節(jié)[7]。HIF-2α缺失會(huì)造成機(jī)體脂代謝的異常[29]。低氧暴露所致的食欲下降僅發(fā)生在低氧暴露初期，隨著低氧時(shí)間的延長，食欲逐漸恢復(fù)至常氧水平，但仍可達(dá)到降低體重的效果，這可能與長期低氧暴露通過刺激HIF-2α以促進(jìn)脂代謝有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，低氧暴露和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后肥胖小鼠的體重和血脂血糖水平下降，并伴隨著Ghrelin-GHSR通路的上調(diào)，但攝食量并未出現(xiàn)明顯下降，提示低氧和運(yùn)動(dòng)通過Ghrelin-GHSR通路改善高脂膳食所致肥胖主要與胃腸功能增強(qiáng)和糖脂代謝機(jī)能促進(jìn)有關(guān)。而低氧訓(xùn)練中，低氧和運(yùn)動(dòng)的雙重刺激加速了肥胖機(jī)體的糖脂代謝能力，從而更有利于控制機(jī)體的血糖血脂水平及抵抗高脂膳食對體重的增加。

肥胖小鼠胃組織Ghrelin和下丘腦GHSR水平降低，伴隨著血脂血糖水平的升高和體重的增加；低氧訓(xùn)練通過肥胖小鼠Ghrelin-GHSR通路影響糖脂代謝，改善肥胖機(jī)體體重和血脂血糖穩(wěn)態(tài)。