淋巴細(xì)胞活化基因-3敲除(Lag-3-/-)小鼠構(gòu)建及初步表型分析

萬穎寒，慈磊，王玨，龔慧，萬志鵬，奚駿，何敏珠，孫瑞林，費(fèi)儉2,，沈如凌*

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203； 2. 模式生物技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203/同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092； 3. 上海南方模式生物科技股份有限公司，上海 201318；4. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

Lag-3全稱淋巴細(xì)胞激活基因-3，又稱為CD223和Ly66，是一種定位于膜上的糖蛋白，屬于免疫球蛋白(lg)超家族成員，含有四個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。Lag-3在活化的T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)、天然殺傷性細(xì)胞(NK)和B細(xì)胞上表達(dá)[1-2]。 T細(xì)胞激活后，白細(xì)胞介素2(IL-2)，IL-7和IL-12會(huì)上調(diào)Lag-3的表達(dá)，Lag-3以比CD4更高的親和力與MHC II類分子結(jié)合，對CD3T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物信號(hào)傳導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的過度活化和增殖，調(diào)控體內(nèi)的免疫平衡[2-3]。Lag-3也參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，其通過阻斷T細(xì)胞抗腫瘤功能的恢復(fù)途徑在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮重要作用[4]，因此在免疫治療中是一個(gè)重要的免疫檢查點(diǎn)分子，受到廣泛關(guān)注[5-7]。

鑒于Lag-3基因在體內(nèi)的重要功能，早在1996年就建立了第一個(gè)Lag-3體內(nèi)基因敲除小鼠模型，利用該模型首先發(fā)現(xiàn)Lag-3基因缺失顯著影響了NK細(xì)胞的活性[8]，在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)Lag-3不但調(diào)控活化T細(xì)胞的擴(kuò)增[9]，還調(diào)節(jié)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[10]；在自身免疫疾病研究方面，近年來，利用Lag-3條件敲除小鼠模型，證明Lag-3可通過抑制Treg細(xì)胞的增殖，促進(jìn)自身免疫疾病的發(fā)生，在1型糖尿病小鼠模型中敲除Lag-3可顯著降低1型糖尿病的發(fā)生[11]；這些研究表明，Lag-3在體內(nèi)多種生理、病理過程中扮演了重要角色。

急性肝炎仍然是危害人類生命健康的一類重要疾病。刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的急性肝損傷模型,通過活化Th1細(xì)胞，刺激庫普弗細(xì)胞和肝細(xì)胞釋放TNF-α，IFN-γ等細(xì)胞因子，招募淋巴細(xì)胞浸潤，造成急性肝損傷，是研究人類肝臟自身免疫性肝炎和病毒性肝炎的常用模型。雖已有證據(jù)顯示Lag-3在病毒感染，肝炎等疾病過程中發(fā)揮作用，但還未有報(bào)道對Lag-3在體內(nèi)肝損傷過程中的功能進(jìn)行研究。

為了便于研究Lag-3在急性肝損傷過程中的功能，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了Lag-3 基因敲除小鼠(Lag-3-/-)，并在該模型上首次利用刀豆蛋白誘發(fā)急性肝損傷模型，對Lag-3在急性肝損傷過程中的功能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Lag-3-/-小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司儲(chǔ)存(儲(chǔ)存編號(hào)：PR1-20180509)20只SPF級雌性C57BL/6小鼠，4周齡，體重10 ～ 12 g；5只SPF級雌性C57BL/6小鼠，8周齡，體重18 ～ 20 g；20只SPF級雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體重10 ～ 12 g；12只SPF級雌性ICR假孕小鼠，8周齡，體重28 ～ 30 g；12只SPF級雄性ICR結(jié)扎小鼠8周齡，體重28 ～ 30 g；由上海南方模式生物科技股份有限公司繁育提供【SCXK(滬)2014-0002】。飼養(yǎng)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK (滬) 2014-0002】，按照SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)要求進(jìn)行飼養(yǎng)。所有操作均由上海南方模式生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)審批通過(審批號(hào)：IACUC號(hào)2017-0032)。

1.1.2 主要試劑

pX-T7-sgRNA質(zhì)粒、Cas9表達(dá)載體由上海南方模式生物科技股份有限公司構(gòu)建。質(zhì)粒小量提試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，MESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit試劑盒購自Ambion公司；APC標(biāo)記大鼠抗小鼠Lag-3抗體購自Biolegend公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞及各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、 T4 DNA連接酶和PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA 設(shè)計(jì)和表達(dá)載體構(gòu)建

小鼠Lag-3基因定位于第6 條染色體的19F2-F3 區(qū)段(Chromosome 19: 124,904,361-124,911,705，ENSMUSG00000032217.1)，全長2001 bp，有8個(gè)的外顯子，表達(dá)蛋白全長521 aa。針對小鼠Lag-3基因結(jié)構(gòu)，通過在線sgRNA設(shè)計(jì)軟件(http: / /crispr.mit.edu /)，針對敲除區(qū)域(exon 2)在intron 1和intron 2中設(shè)計(jì)sgRNA，最終在兩個(gè)intron中各選擇2個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)，sgRNA序列信息分別為：sgRNA1: 5′-CATCATGCCTCCCTGTTGAA-3′; sgRNA2: 5′-TGCCTCAGCCTCCCTTCAAC-3′; sgRNA3: 5′-AC TACAGGATGCCGGTGTGT-3′;sgRNA4: 5′-GTGGA TTGCTCCCCACACAC-3′。根據(jù)4個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)合成相應(yīng)的oligoDNA用于sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建。

設(shè)計(jì)4 對針對Lag3基因的sgRNA 寡聚核苷酸鏈: 正義鏈1： 5′-CACCGCATCATGCCTCCCTG TTGAA-3′，反義鏈1： 5′-AAACTTTCAACAGGGAGG CATGATG-3′；正義鏈2： 5′-CACCGTGCCTC AGCCTCCCTTCAAC-3′，反義鏈2： 5′-AAACT GTTGAAGGGAGGCTGAGGCA-3′； 正義鏈3： 5′-CACCG ACTACAGGATGCCGGTGTGT-3′，反義鏈3： 5′-AAACTACACACCGGCATCCTGTAGT-3′； 正義鏈4： 5′-CACCGGTGGATTGCTCCCCACACAC -3′，反義鏈4： 5′-AAACTGTGTGTGGGGAGCAATCCAC-3′。

將Lag-3 sgRNA 寡核苷酸單鏈以逐步降溫的方法退火成雙鏈。BbsI酶切pX-T7-sgRNA質(zhì)粒使其線性化，回收后與4個(gè)寡核苷酸雙鏈分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；挑選抗性單克隆提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測序鑒定，鑒定正確的陽性克隆保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 sgRNA 和Cas9表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)錄

sgRNA的表達(dá)載體pX-T7-sgRNA 經(jīng)酶切線性化后，按照HiScribeTMT7 High Yield RNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行體外合成；Cas9表達(dá)載體經(jīng)酶切線性化，按照mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Transcription Kit試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 陽性小鼠品系獲得及鑒定

通過顯微注射將Cas9 mRNA和sgRNA注射到C57BL/6小鼠受精卵胞質(zhì)中，注射后受精卵移植到假孕雌鼠子宮中，待出生后獲得F0代小鼠，PCR方法篩選陽性基因型的F0代小鼠。Lag-3基因敲除F1代雜合子小鼠(Lag-3-/+)由F0代陽性小鼠與C57BL/6野生型小鼠交配獲得，引物對P1/P2序列信息為：P1:5′-GCTTCTGGGACTGCTTTGG-3′；P2:5′-GGGTTGTCTAGGCGAGGG-3′，PCR產(chǎn)物測序鑒定。PCR條件為：94 ℃ 3 min; 35個(gè)循環(huán)的95 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min; 72 ℃ 5 min。F2代Lag-3基因敲除純合子小鼠(Lag-3-/-)模型由F1代雜合子小鼠自交獲得，基因型鑒定策略同F(xiàn)1代小鼠。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測

將刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)通過尾靜脈按12 mg/kg劑量注射到小鼠體內(nèi)，18 h后取材。按照TRIzol RNA抽提試劑說明書，分別從脾、腹腔巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)中分離抽提細(xì)胞總RNA。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen)將分別來自Lag-3-/-和野生型小鼠的RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；TransStart Top Green qPCR SuperMix(Transgen)用于實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95℃ 3 min； 40個(gè)循環(huán)的95℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s；95℃ 15 s，60℃ 15 s。Lag-3特異性引物序列信息為：上游序列：5′-CCTGGATCCTAACTTTCTACGAAG-3′，下游序列：5′-CGCTCAGCACCGTGTAG-3′。小鼠β-actin基因作為Lag-3基因表達(dá)水平的內(nèi)參。β-actin引物序列信息為：上游序列：5′-ATTGCTG ACAGGATGCAGAA-3′，下游序列：5′-GCTGATCC ACATCTGCTGGAA-3′。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測Lag-3表達(dá)

將ConA通過尾靜脈按12 mg/kg劑量注射到小鼠體內(nèi)，18 h后取材。異氟烷麻醉小鼠后，取脾淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)，過篩網(wǎng)后分別獲得細(xì)胞懸液；經(jīng)去除紅細(xì)胞和PBS洗滌后，①用熒光抗體APC anti-mouse Cd223(Lag-3)對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，檢測Lag-3表達(dá)；②用熒光抗體FITC anti-mouse CD3e和APC anti-mouse Cd223(Lag-3)對細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)，檢測Lag-3在T細(xì)胞上的表達(dá)，標(biāo)記后的細(xì)胞，在冰上避光孵育20 min，將細(xì)胞重懸于Stain Buffer中(含1%FBS的PBS)，Stain Buffer洗滌兩次后按常規(guī)方法上流式細(xì)胞儀CytoFlex檢測，每個(gè)樣品檢測收集10 000 個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用CellQuest軟件分析。

1.2.6 血生化檢測

同窩生Lag-3-/-小鼠和野生型小鼠經(jīng)ConA注射處理(方法同1.2.5)，18 h后小鼠經(jīng)異氟烷麻醉進(jìn)行眼球取血，未經(jīng)刀豆蛋白注射的同窩Lag-3-/-小鼠和野生型小鼠同樣進(jìn)行眼球取血，使用全自動(dòng)生化分析儀(日立7180型)對血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2.7 組織和病理學(xué)檢測

同窩生Lag-3-/-小鼠和野生型小鼠經(jīng)ConA注射處理(方法同1.2.5)后進(jìn)行各組織器官取材、稱重，同窩生未經(jīng)刀豆蛋白注射的Lag-3-/-小鼠和野生型小鼠同時(shí)進(jìn)行取材。組織拍照后，小鼠各組織器官經(jīng)過PBS清洗后固定于4%多聚甲醛中，組織包埋切片后H&E染色拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lag-3-/-小鼠的制備

Lag-3-/-小鼠的構(gòu)建策略如圖1所示，Cas9/sgRNA將Lag-3基因exon 2敲除，exon 2區(qū)域的缺失將造成蛋白讀碼框移碼，Lag-3蛋白無法正確翻譯，從而造成基因功能性缺失。將轉(zhuǎn)錄后的Lag-3 sgRNA和Cas9 mRNA混合物通過顯微注射方式注射到C57BL/6小鼠受精卵胞質(zhì)中，180枚經(jīng)過顯微注射的受精卵移植到9只ICR假孕鼠輸卵管中，共出生36只F0代小鼠(出生率為20%)，經(jīng)PCR對F0代小鼠的基因型進(jìn)行鑒定，凝膠電泳結(jié)果(圖2)顯示29只小鼠中能檢測到Cas9/gRNA作用后的變小條帶(陽性率80%)，選擇其中2只雄性小鼠(5號(hào)和23號(hào))分別與野生型C57BL/6雌鼠交配，PCR鑒定加產(chǎn)物測序，確定F1代突變雜合子小鼠有2種基因類型：敲除類型1為缺失421個(gè)堿基對；敲除類型2為缺失405個(gè)并且替換2個(gè)堿基對。選擇敲除類型1型的F1代Lag-3-/+小鼠進(jìn)行自交，獲得F2代Lag-3-/-小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，陽性小鼠鑒定結(jié)果如圖3所示。

2.2 Lag-3-/-小鼠mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證

注射ConA刺激后采用Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分別在mRNA和蛋白水平檢測Lag-3基因敲除小鼠敲除效果。RT-PCR結(jié)果如圖4A所示：ConA刺激后，Lag-3敲除純合子小鼠的心臟、脾、肺、腎、骨髓組織和腹腔巨噬細(xì)胞的Lag-3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于野生型小鼠(P< 0.001)。利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的Lag-3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖4B-C所示：Lag-3-/-小鼠的Lag-3信號(hào)水平非常低，腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中可檢測到的Lag-3信號(hào)表達(dá)分別占父群的(0.7 ± 0.36)%，(0.66 ± 0.48)%和(0.28 ± 0.09)%；而相應(yīng)的野生型小鼠的Lag-3信號(hào)水平分別占父群的(12.39 ± 2.63)%，(24.5 ± 3.56)%和(5.73 ± 0.6)%。該結(jié)果從mRNA和蛋白水平上證明已成功構(gòu)建Lag-3-/-小鼠。

注：針對敲除區(qū)域(exon2), Cas9/sgRNA識(shí)別并剪切目標(biāo)靶序列，將Lag-3基因exon 2敲除。圖1 Lag-3-/-小鼠構(gòu)建策略Note. For the knockout region (exon2), the Cas9/sgRNA complex knocks out the Lag-3 gene exon 2 by recognizing and cleaving the target sequence.Figure 1 Lag-3-/- mice construction strategy

注：A：Lag-3基因F0代小鼠敲除小鼠鑒定策略；B：F0代小鼠基因型鑒定電泳結(jié)果。圖2 F0代小鼠基因型鑒定Note. A, Identification strategy of Lag-3 gene knockout mice in the F0 generation. B, Electrophoresis results of genotype identification in F0 generation mice.Figure 2 Genotype identification of F0 generation mice

注：A：Lag-3-/-小鼠基因型鑒定策略；B：Lag-3-/-小鼠基因型鑒定電泳結(jié)果。野生型小鼠PCR產(chǎn)物為一條990 bp條帶；Lag-3-/+小鼠PCR產(chǎn)物為990 bp和569 bp兩條帶；Lag-3-/-小鼠PCR產(chǎn)物為一條569 bp條帶。WT-野生型小鼠，HE-Lag-3-/+小鼠，HO-Lag-3-/-小鼠。圖3 F2代小鼠基因型鑒定Note. A, Genotype identification strategy for Lag-3-/- mice. B, Electrophoresis results of genotype identification in Lag-3-/- mice. The wild-type mouse PCR product was a 990 bp band; the Lag-3-/+ mouse PCR product was two bands of 990 bp and 569 bp; and the Lag-3-/-mouse PCR product was a 569 bp band. WT-wild type mice, HE-Lag-3-/+ mice, HO-Lag-3-/-mice.Figure 3 Genotype identification of F2 mice

2.3 ConA刺激前后Lag-3-/-小鼠CD3+T細(xì)胞比例變化

利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)對小鼠血液、骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞表達(dá)檢測，結(jié)果如圖5所示：未注射ConA的情況下，和野生型小鼠相比，Lag-3-/-小鼠的血液和脾細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞比例無顯著性差異，但骨髓中的CD3+T細(xì)胞比例顯著性低于野生型小鼠；ConA刺激后，野生型小鼠血液中的CD3+T細(xì)胞顯著性升高，骨髓和脾中的CD3+T細(xì)胞比例略有下降，但沒有顯著性差異；而在Lag-3-/-小鼠中，ConA刺激后，小鼠血液、骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞比例較刺激前均顯著性降低。該結(jié)果說明Lag-3基因敲除顯著降低了ConA刺激后小鼠CD3+T細(xì)胞量。

注：A：Lag-3基因敲除野生型和純合子小鼠組織Lag-3 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果；B：不同基因型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中Lag-3百分含量柱狀圖。與注射ConA的野生型小鼠組相比，**P< 0.01，***P< 0.001；C：不同基因型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中Lag-3表達(dá)情況散點(diǎn)示意圖。APC標(biāo)記熒光抗體anti-CD223檢測。圖4 Lag-3-/-小鼠mRNA和蛋白相對表達(dá)水平檢測(n=3)Note. A, Detection of Lag-3 mRNA expression levels in tissues of wild-type and Lag-3 gene knockout homozygous mouse tissue. B, Bar chart of Lag-3 percentage content in peritoneal macrophages, spleen cells and lymph nodes of mice with different genotypes. Compared to WT with ConA,**P< 0.01,***P< 0.001. C, Scatter plot of Lag-3 positive cell in peritoneal macrophages, spleen cells and lymph nodes of mice with different genotypes. APC labeled fluorescent antibody anti-CD223.Figure 4 Detection of relative mRNA and protein expression levels in Lag-3-/- mice(n=3)

注：A：野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠血液、脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞比例散點(diǎn)示意圖；FITC標(biāo)記熒光抗體anti-CD3檢測；B：野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠血液、脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖；與注射ConA Lag-3-/-組相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Lag-3-/-小鼠ConA刺激前后CD3+T細(xì)胞比例變化Note. A, Scatter plot of the ratio of CD3+T cells in blood, spleen cells and bone marrow cells in wild-type and Lag-3-/- mice; FITC-labeled fluorescent antibody anti-CD3 assay. B, Statistical map of the ratio of CD3+T cells in blood, spleen cells and bone marrow cells of wild-type and Lag-3-/- mice. Compared to WT with ConA,*P < 0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001.Figure 5 Changes in the ratio of CD3+T cells in Lag-3-/- mice by flow cytometry before and after ConA stimulation

2.4 Lag-3基因敲除減輕ConA誘導(dǎo)引起的小鼠肝損傷

注：A：野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠經(jīng)ConA給藥誘導(dǎo)前后，小鼠的肝功能指標(biāo)變化：ALT-谷丙轉(zhuǎn)氨酶，AST-谷草轉(zhuǎn)氨酶，每組3只小鼠。與Lag-3-/-組或注射ConA Lag-3-/-組相比，*P< 0.05，***P< 0.001； B：ConA誘導(dǎo)前后小鼠主要組織病理圖C：組織所占體重比；D，野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠ConA誘導(dǎo)前后，小鼠臟和脾H&E染色圖(比例尺=60 μm)。圖6 ConA誘導(dǎo)前后，野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠病理檢測Note. A, Changes in liver function indexes of wild-type and Lag-3-/- mice before and after injection with ConA. ALT-alanine aminotransferase, AST-aspartate aminotransferase, 3 mice per group (Compared to Lag-3-/-or Lag-3-/- with ConA,*P <0.05,***P <0.001. B, Photograph of main tissues of mice before and after ConA injection. scale bar=1 cm, 3 mice per group. C, Measurement of tissue/body weight ratio of mice before and after ConA injection. D, HE staining of liver and spleen before and after ConA injection in wild type mice and Lag-3-/- mice, scale bar=60 μm.Figure 6 Pathological detection of wild-type mice and Lag-3-/-mice before and after ConA induction

分別取ConA注射前后的野生型和Lag-3-/-小鼠血清，進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測，如圖6A所示：誘導(dǎo)前兩組小鼠的肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平無差異，注射ConA后，兩組小鼠的肝功能指標(biāo)ALT和AST均有大幅度增加，但野生型小鼠的ALT和AST增幅比Lag-3-/-小鼠更大，兩組小鼠之間有顯著性差異；分別取誘導(dǎo)前后的野生型和Lag-3-/-小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎和胸腺組織進(jìn)行稱重和病理檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)前后各組小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎和胸腺按組織/體重比分析，差異無顯著性(圖6C)；取組織拍照(圖6B)并進(jìn)行H&E染色后病理學(xué)觀察(圖6D)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后野生型小鼠的肝和脾組織充血更明顯。該結(jié)果說明Lag-3基因敲除可以減輕ConA誘導(dǎo)的肝損傷。

3 討論

在過去十年中，旨在激活免疫系統(tǒng)以攻擊癌細(xì)胞的療法是對抗癌癥的重要策略之一。

我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，通過受精卵直接注射Cas9 mRNA和guideRNA,構(gòu)建了C57BL/6背景的Lag-3-/-小鼠模型，獲得的F0代小鼠80%都可以檢測到CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯效果，證明我們的設(shè)計(jì)方案和采用的方法是一個(gè)高效快速獲得Lag-3基因敲除小鼠的方法。

通過對小鼠心臟、脾、肺、巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)Lag-3 RNA水平表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，基因敲除純合子小鼠只能檢測到本底信號(hào)，證明RNA水平實(shí)現(xiàn)了對Lag-3基因的敲除。在隨后的蛋白水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，盡管Lag-3具有廣泛的表達(dá)譜[12]，但根據(jù)我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用流式檢測的方法發(fā)現(xiàn)：正常情況下，小鼠的脾、腹腔巨噬細(xì)胞、骨髓和淋巴結(jié)的Lag-3表達(dá)水平很低(數(shù)據(jù)未顯示)，而刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)處理可以顯著上調(diào)小鼠體內(nèi)腹腔巨噬細(xì)胞、淋巴結(jié)和脾Lag-3的表達(dá)，這與以前的報(bào)道，活化的T細(xì)胞中Lag-3表達(dá)上調(diào)相一致。野生型小鼠和Lag-3-/-小鼠的對比發(fā)現(xiàn)，與ConA處理前相比，野生型小鼠Lag-3表達(dá)明顯上調(diào)，而Lag-3-/-小鼠心臟、脾和腹腔巨噬細(xì)胞中Lag-3 mRNA處于本底水平，與野生型小鼠相比有顯著區(qū)別，同樣流式檢測方法檢測腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中Lag-3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)也在本底水平。 這些數(shù)據(jù)表明，我們已成功構(gòu)建Lag-3基因敲除小鼠品系。

對Lag-3基因敲除小鼠的初步表型分析發(fā)現(xiàn)，Lag-3-/-小鼠骨髓中的CD3+T細(xì)胞比例顯著減少，而外周血和脾中的CD3+T細(xì)胞比例沒有顯著性變化；但我們用T細(xì)胞激活的刺激劑ConA處理小鼠后發(fā)現(xiàn)，Lag-3-/-小鼠無論骨髓、外周血還是脾中的CD3+T細(xì)胞比例較野生型小鼠均有非常顯著降低，尤其Lag-3-/-小鼠外周血CD3+T細(xì)胞比例只有野生型的1/15，我們推斷Lag-3的缺失影響了T細(xì)胞的增殖，造成無法響應(yīng)ConA的刺激。

ConA作為一種T細(xì)胞激活劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常用于誘導(dǎo)急性肝損傷，模擬人類肝臟自身免疫性肝炎和病毒性肝炎。ConA刺激初步表型分析結(jié)果顯示，基因敲除小鼠可能在肝損傷方面有相應(yīng)的表型缺陷。另外，根據(jù)2018年Wang等[13]新的研究結(jié)果，與原來認(rèn)為的MHC-II是Lag-3唯一的配體不同，纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)而非MHC-II是Lag-3主要的功能配體。FGL1是一個(gè)分泌蛋白，正常情況下，在體內(nèi)主要在肝中表達(dá)，表明Lag-3可能在肝生理病理過程中發(fā)揮重要功能。基于這兩方面的證據(jù)，我們用ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷模型對野生型和Lag-3-/-小鼠的響應(yīng)情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示Lag-3基因敲除可以顯著減輕ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷。目前對Lag-3研究的熱點(diǎn)，主要集中在其作為一個(gè)重要的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)，通過與PD1靶點(diǎn)的協(xié)同作用進(jìn)行抗腫瘤研究[5-6]。我們的研究結(jié)果顯示，Lag-3也可能是一個(gè)治療急性肝損傷的靶點(diǎn)，目前多家藥企已經(jīng)開發(fā)了相應(yīng)的抗體藥物，并且進(jìn)入臨床，這些藥物后續(xù)也有可能用于自身免疫性或者病毒性急性肝損傷的治療。

綜上所述，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，建立了Lag-3基因敲除小鼠品系，在RNA和蛋白水平對該基因的敲除效果進(jìn)行了驗(yàn)證，并通過ConA誘發(fā)的肝損傷模型，證明了Lag-3在急性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用，為Lag-3體內(nèi)基因功能研究提供了新的模型，為急性肝損傷的治療提供了新的線索。