電針對糖尿病神經(jīng)痛大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白的干預(yù)作用

邰昭霞，費雪瑜，瞿思穎，王涵芝，陳盧杭，蔣永亮，方劍喬*，何曉芬*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院康復(fù)醫(yī)學院，杭州 310053； 2. 浙江省針灸神經(jīng)病學研究重點實驗室，杭州 310053； 3. 浙江中醫(yī)藥大學針灸研究所，杭州 310053)

糖尿病神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚不明確，有研究表明其與代謝、細胞信號通路以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的改變等因素有關(guān)，嚴重影響患者生活質(zhì)量，且缺乏有效的治療手段[1]。尋找有效治療糖尿病神經(jīng)痛的方法，是糖尿病并發(fā)癥防止領(lǐng)域亟待解決的問題。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要作用[2]。NF-κB p65是NF-κB家族最重要的成員，也是最常見的活化形式；有研究表明，NF-κB p65在大鼠DNP的發(fā)生過程起著重要作用[3]。目前電針被廣泛用于治療各種慢性疼痛，它能有效控制糖尿病神經(jīng)痛[4-5]，且有研究表明在大腦中動脈閉塞模型中，電針能下調(diào)梗死灶周圍組織中NF-κB p65的表達[6]。但電針干預(yù)DNP是否通過下調(diào)脊髓NF-κB p65來起到干預(yù)糖尿病神經(jīng)痛的作用尚有待明確。因此，本實驗選取高脂高糖飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘導的糖尿病神經(jīng)痛模型，探討電針對糖尿病神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用是否與有效干預(yù)DNP大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用6周齡健康雄性SPF級SD大鼠30只，體重(180 ± 20)g，購自中國科學院上海實驗動物中心【SCXK(滬)2013-0016】，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心飼養(yǎng)【SYXK (浙) 2013-0184】。自由飲水，晝夜明暗周期12 h/12 h。所有實驗操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號為：IACUC-20180319-13)。

1.1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Sigma，S0130), 兔抗NF-κB p65 抗體(CST，8242)，山羊抗兔二抗(CST，7074)，RIPA裂解液(碧云天，P0013B)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，23227)，SDS上樣緩沖液(碧云天，P0015B)，ECL發(fā)光顯色液(碧云天，P0018)，足底熱輻射測痛儀(意大利UGO BASILE，37360)，動態(tài)足底測痛儀(意大利UGO BASILE，37450)，羅氏卓越型血糖儀(Roche ACCU-CHEK Performa)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模

將30只大鼠，隨機分為正常組(normal group，n=8)和造模組(n=22)。正常組用嚙齒類動物標準顆粒飼料飼養(yǎng)，造模組用高脂高糖飼料喂養(yǎng)(72.5%普通飼料 + 10%豬油 + 10%蔗糖 + 2%膽固醇 + 0.5%膽酸鈉 + 5%蛋黃粉；購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心)，喂養(yǎng)5周后禁食16 h，造模組以小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，35 mg/kg)腹腔注射1次，正常組僅腹腔注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。于STZ注射后2周即第7周分別測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、熱痛閾(paw withdrawal latency，PWL)、機械痛閾(paw withdrawal threshold，PWT)，F(xiàn)BG ≥ 11.1 mmol/L并且痛閾下降≥15%[7]的造模組大鼠入選糖尿病神經(jīng)痛模型。其余未達到此標準者則予以剔除。將造模成功的糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠再隨機分為糖尿病神經(jīng)痛組(DNP group，n=9)和糖尿病神經(jīng)痛+電針組(DNP+EA group，n=9)。

1.2.2 空腹血糖測定

分別于0周(base)、5周(5 weeks)、7周(7 weeks)、8周(8 weeks)這4個時間點檢測大鼠的FBG。大鼠禁食8 h后尾靜脈取血用羅氏卓越型血糖儀及其配套試紙測定各組大鼠的FBG。

1.2.3 機械痛閾測定

參照壽升蕓等[7]測定大鼠機械痛閾方法，采用動態(tài)足底觸覺儀檢測各組大鼠0周(base)、5周(5 weeks)、7周(7 weeks)、8周(8 weeks)這4個時間點的PWT，每只大鼠連續(xù)測量5次，每次測量間隔5 min，去除最大值和最小值，最終取3次的平均值作為大鼠機械痛閾值。

1.2.4 熱痛閾測定

參照項璇兒等[8]測定大鼠PWL的方法，采用足底熱輻射測痛儀檢測各組大鼠0周(base)、5周(5 weeks)、7周(7 weeks)、8周(8 weeks)這4個時間點的熱痛閾。連續(xù)測量5次，每次間隔5 min，去除最大值和最小值，取3次平均值作為大鼠熱痛閾。

1.2.5 電針干預(yù)

電針干預(yù)方法：大鼠固定后，參照華興邦大鼠穴位圖譜，選取雙側(cè)足三里(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下5 mm)、昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)，采用0.25 mm×1 mm針灸針，進針后用LH-202H韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀連接兩穴位，電針頻率為2 Hz、強度為1 mA干預(yù)15 min后2 mA干預(yù)15 min，共30 min。電針干預(yù)于第7周開始，每天1次，共7次。Normal組大鼠和DNP組大鼠僅給予和DNP+EA組相同的固定。

1.2.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察坐骨神經(jīng)的變化

大鼠用戊巴比妥腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，先經(jīng)生理鹽水(4℃預(yù)冷)快速灌注，再4%多聚甲醛灌注后取出大鼠坐骨神經(jīng)中段(距近心端3 mm，遠心端2 mm)置于2.5%的戊二醛溶液中固定。再經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、染色、脫水及封固等步驟后觀察。

1.2.7 免疫印跡法檢測大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白的表達

大鼠用戊巴比妥腹腔注射麻醉，經(jīng)生理鹽水(4℃預(yù)冷)快速灌注后，參照杜俊英等[9]提取脊髓的方法，剪斷脊柱兩旁的肋骨，剪取第四腰椎節(jié)段以上約5 cm左右的脊柱，用50 mL注射器沖出脊髓。留取腰膨大部分，從正中分開成左右兩側(cè)，用刀片切取脊髓背角。用RIPA裂解液提取脊髓背角總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入SDS上樣緩沖液后在100℃條件下變性3 min。通過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉中封閉1 h后于兔抗NF-κB p65 一抗(1∶1000)稀釋液中孵育過夜，洗滌后與山羊抗兔二抗(1∶5000)搖床孵育2 h。與ECL發(fā)光顯色液反應(yīng)顯影，利用LAS4010凝膠成像儀采集圖像，圖片用Image J分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖變化情況

如圖1所示，各組大鼠基礎(chǔ)(base)血糖及高脂高糖喂養(yǎng)5周(5 weeks)血糖均無明顯差異；高脂高糖喂養(yǎng)5周后予以STZ單次腹腔注射2周后即第7周(7 weeks)，DNP組及DNP+ EA組大鼠血糖明顯上升(P< 0.01；P< 0.01)；電針干預(yù)1周(8 weeks)對DNP大鼠血糖無明顯作用。

2.2 各組大鼠機械痛閾變化情況

如圖2所示，各組大鼠基礎(chǔ)(base)機械痛閾及高脂高糖喂養(yǎng)5周(5 weeks)機械痛閾均無明顯差異；高脂高糖喂養(yǎng)5周后予以STZ單次腹腔注射2周后即第7周(7 weeks)，DNP組及DNP+ EA組大鼠機械痛閾明顯下降(P< 0.01；P< 0.01)；電針干預(yù)1周(8 weeks)能上調(diào)DNP大鼠的機械痛閾(P< 0.01)。

注：與正常組相比，**P< 0.01，與糖尿病神經(jīng)痛組相比，##P< 0.01。圖2 各組大鼠機械痛閾變化情況Note.**P< 0.01, vs the Normal group. ##P< 0.01, vs the DNP group.Figure 2 Changes of paw withdrawal threshold in rats of each group

2.3 各組大鼠熱痛閾變化情況

如圖3所示，各組大鼠基礎(chǔ)(base)熱痛閾及高脂高糖喂養(yǎng)5周(5 weeks)熱痛閾均無明顯差異；高脂高糖喂養(yǎng)5周后予以STZ單次腹腔注射2周后即第7周(7 weeks)，DNP組及DNP+ EA組大鼠熱痛閾明顯下降(P< 0.01；P< 0.01)；電針干預(yù)1周(8 weeks)能上調(diào)DNP大鼠的熱痛閾(P< 0.01)。

注：與正常組相比，**P< 0.01，與糖尿病神經(jīng)痛組相比，##P< 0.01。圖3 各組大鼠熱痛閾變化情況Note. **P< 0.01, vs the Normal group.##P< 0.01, vs the DNP group.Figure 3 Changes of paw withdrawal latency in rats of each group

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)變化情況

HE染色觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)的變化情況。如圖4所示，正常組：坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維排列緊密，軸索排列整齊，髓鞘結(jié)構(gòu)完整；DNP組：坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維排列紊亂，軸索腫脹，髓鞘密度不均勻，空泡變性。DNP+EA組：坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維排列紊亂，軸索腫脹。

2.5 各組大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白表達的變化

采用免疫印跡法檢測大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白的表達。如圖5所示，與正常組相比，DNP大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白表達增多(P< 0.05)，電針干預(yù)能下調(diào)DNP大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白的表達(P< 0.05)。

注：與正常組相比，*P< 0.05，與糖尿病神經(jīng)痛組相比，#P< 0.05。圖5 各組大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白變化Note.*P< 0.05, vs. the Normal group.#P<0.05, vs. the DNP group.Figure 5 Changes of NF-κB p65 in the spinal cord dorsal horn of rats in each group

3 討論

糖尿病神經(jīng)痛是糖尿病常見的并發(fā)癥[10]，既有痛覺過敏、痛覺超敏、自發(fā)痛等神經(jīng)病理性疼痛的一般表現(xiàn)[11]，也會引起不同程度的抑郁、焦慮、失眠等，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[12]。鏈脲佐菌素能針對性的損傷胰島β細胞從而使胰腺減少胰島素分泌，因此被廣泛應(yīng)用于誘導糖尿病模型[13]。本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)5周聯(lián)合單次腹腔注射STZ建立糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型，大鼠出現(xiàn)血糖明顯上升，機械痛閾和熱痛閾下降，坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維排列紊亂，軸索腫脹，髓鞘密度不均勻，空泡變性。

大量研究表明，電針對不同類型的疼痛都具有良好的鎮(zhèn)痛效果[8,14-15]，但不同頻率的電針對不同性質(zhì)的疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)不同。100 Hz的高頻電針對于完全弗氏佐劑所致的炎性痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)最好[8]、2/100 Hz對于骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)最佳[14]、而2 Hz低頻電針對于脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理痛大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)最佳[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)糖尿病神經(jīng)痛存在2 Hz低頻電針優(yōu)于100 Hz高頻電針的優(yōu)勢[16]，故本研究采用2 Hz低頻電針對糖尿病神經(jīng)痛大鼠進行干預(yù)，結(jié)果顯示低頻電針可明顯提高DNP大鼠的機械痛閾和熱痛閾，表明低頻電針能有效緩解糖尿病神經(jīng)痛。

NF-κB家族主要有p50/p105(NF-κB1)、p50/p100(NF-κB2)、c-Rel、p65(RelA)、RelB五種蛋白組成，其中p65是NF-κB家族中最主要的功能蛋白。NF-κB在藥物引起的神經(jīng)痛模型大鼠脊髓背角表達上升，說明NF-κB參與了神經(jīng)病理痛[17]。在本研究中免疫印記結(jié)果顯示，DNP模型大鼠脊髓背角NF-κB p65蛋白較正常組大鼠增多。在高血糖的狀態(tài)下，NF-κB活性持續(xù)升高，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，激活小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，這進一步增加了炎性介質(zhì)的釋放，釋放的神經(jīng)介質(zhì)促進了神經(jīng)纖維對疼痛刺激敏感的敏感程度[18]。免疫印記結(jié)果顯示電針能降低糖尿病神經(jīng)痛大鼠脊髓背角中升高的NF-κB p65蛋白，表明低頻電針對DNP的干預(yù)作用可能與其對有效抑制脊髓背角NF-κB p65蛋白表達有關(guān)。

綜上，低頻電針能有效改善糖尿病神經(jīng)痛，與其抑制脊髓背角NF-κB p65蛋白的表達有關(guān)，表明了低頻電針在糖尿病神經(jīng)痛臨床中有較好的應(yīng)用前景，為電針治療糖尿病神經(jīng)痛提供了部分理論依據(jù)。