阿魏酸對(duì)高脂血癥小鼠肝脂肪變性及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

饒文婷，羅尚菲，張雅心，江偉豪，陳奕澔，陳嘉慧，任妍，佘楷杰，何盈，曾平，周鳳華*

(1．南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515；2．廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州 510100)

腸道菌群是一個(gè)極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，參與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)消化吸收、生物拮抗、免疫、抗腫瘤等一系列生命活動(dòng)并維持機(jī)體健康[1]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的高脂飲食可以長(zhǎng)期而持續(xù)地改變腸道微生態(tài)，腸道菌群失衡可以引起脂代謝紊亂，導(dǎo)致高脂血癥[2-3]。阿魏酸(ferulic acid)，是當(dāng)歸、黃連等中藥的有效成分之一，能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、代謝綜合征和炎癥，改善血脂、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[4-6]。阿魏酸是否對(duì)高脂血癥小鼠的腸道菌群也有調(diào)節(jié)作用尚且未知。因此,本文采用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，觀察阿魏酸對(duì)其血脂、肝脂肪變性及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步闡明阿魏酸防治高脂血癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性ApoE-/-小鼠24只，雄性C57BL/6小鼠6只，6周齡，SPF級(jí)，體重25 ～ 28 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中【SYXK(粵)2016-0167】，室溫22℃，相對(duì)濕度55%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則，已通過得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：L2018110。

1.1.2 藥品與試劑

阿魏酸(純度:99.32%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào):MUST-18032928)；辛伐他汀片(默沙東制藥公司，批號(hào):H20160429)；血清總膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)生化檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司，批號(hào): 20190304、20190228)；高脂飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，脂肪含量21%，膽固醇0.15%，蛋白質(zhì)15.5%)。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Thermo FC，美國(guó))；PCR儀(BioRad，美國(guó))；凝膠成像儀(Tanon，中國(guó))；電泳儀(北京六一，中國(guó))；NanoDropTMOne(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus IX53，日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠造模

24只ApoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿魏酸組[40 mg/(kg·d)]、辛伐他汀組[5 mg/(kg·d)]，每組6只；6只C57BL/6雄性小鼠為空白組。對(duì)照組和空白組給予普通飼料12周，其他各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)12周；再給予藥物處理12周。阿魏酸組以DMSO配制，按40 mg/(kg·d)灌胃給藥，辛伐他汀組以生理鹽水配制，按5 mg/(kg·d)灌胃給藥，其他組給予同體積蒸餾水。

1.2.2 樣本采集及處理

給藥12周后，每組隨機(jī)選取5只小鼠，收集新鮮正常糞便，保存于-80℃恒溫冰箱。小鼠稱重后禁食12 h，麻醉后心臟取血，3000 r/min、4℃離心15 min后分離血清，按照試劑盒說明，分別檢測(cè)血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C。取小鼠肝，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色；制作冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

1.2.3 糞便腸道菌群檢測(cè)

糞便標(biāo)本解凍以后，用糞便DNA分離試劑盒提取DNA，以每個(gè)樣品提取的DNA為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)，然后對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行清潔和測(cè)序。應(yīng)用IlluminaHiSeq 2500平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序類型為PE250。下機(jī)數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得clean data。序列拼接使用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)，將雙末端測(cè)序得到的reads拼接成Tags，將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)，得到OTU代表序列后，通過核糖體數(shù)據(jù)計(jì)劃(ribosomal database project，RDP)classifer(v2.2)軟件，將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)(Greengene V201305)已知序列比對(duì)進(jìn)行物種注釋，從而得到每個(gè)樣品的群落組成信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對(duì)小鼠體重及血脂水平的影響

模型組小鼠體重明顯高于對(duì)照組(P< 0.01)，阿魏酸組體重明顯低于模型組(P< 0.01)，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P> 0.05)，表明阿魏酸能有效抑制高脂飼料引起的小鼠體重增加。(表1)

模型組血清TC、TG、LDL-C含量明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)，而阿魏酸組血清TC、TG、LDL-C含量明顯低于模型組(P< 0.05)，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)，阿魏酸組較模型組HDL含量增加，但是沒有顯著性差異(P> 0.05)，上述說明阿魏酸能有效改善小鼠的血脂異常。(表1)

表1 阿魏酸對(duì)小鼠體重及血脂的影響Table 1 Effect of ferulic acid on weight and lipid in mice ± s, n=6)

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。與模型組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,#P< 0.05,##P< 0.01.

2.2 阿魏酸對(duì)高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性的影響

如圖1、2所示，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無明顯脂肪變，細(xì)胞質(zhì)未見腫脹，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肝細(xì)胞大泡性脂肪變，肝細(xì)胞氣球樣變，小葉及匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并有點(diǎn)灶狀壞死；阿魏酸組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞脂肪變減輕，細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，炎癥浸潤(rùn)減少，無明顯壞死灶，肝組織結(jié)構(gòu)趨于對(duì)照組水平。

2.3 阿魏酸對(duì)腸道菌群的影響

模型組與對(duì)照組腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異，阿魏酸組與對(duì)照組的間距較模型組更近，說明阿魏酸可以使高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)趨于正常，阿魏酸對(duì)小鼠紊亂的腸道菌群有調(diào)節(jié)作用(圖3A)。

門水平上，各組小鼠腸道菌群均以厚壁菌(Firmicutes)及擬桿菌(Bacteroidetes)為主要優(yōu)勢(shì)菌。模型組厚壁菌的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，而擬桿菌的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，阿魏酸可以抑制高脂喂養(yǎng)引起的改變(圖3B)。模型組小鼠腸道菌群F/B比值明顯高于對(duì)照組，阿魏酸組F/B比值較模型組顯著降低。

科水平上，模型組中韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、穆里巴庫(kù)拉菌科(Muribaculaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，阿魏酸可以抑制這些改變(圖3C)。

屬水平上，模型組Ileibacterium的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，阿魏酸可以降低Ileibacterium的豐度(圖3D)。阿魏酸組Lachnospiraceae_UCG-010、Odoribacter等顯著富集(圖4)。

圖1 阿魏酸對(duì)肝組織病理形態(tài)的影響(HE染色)Figure 1 Effect of ferulic acid on pathological morphology of liver (HE staining)

圖2 阿魏酸對(duì)肝組織內(nèi)脂滴的影響(油紅O染色)Figure 2 Effect of ferulic acid on lipid droplets in liver (Oil red O staining)

圖3 阿魏酸對(duì)腸道菌群的影響Figure 3 Effect of ferulic acid on intestinal flora

圖4 屬水平豐度差異腸道菌LDA得分Figure 4 LDA scores of gut microbiota with different abundance in genus level

3 討論

高脂血癥又稱脂質(zhì)代謝紊亂或異常，是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等疾病的危險(xiǎn)因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，這種改變會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)高脂血癥以及肝臟脂代謝紊亂[8]。

本實(shí)驗(yàn)中高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠在阿魏酸的干預(yù)下，體重及血清TC、TG、LDL-C水平都顯著降低，肥胖和血脂異常的情況得到明顯改善。阿魏酸組小鼠肝細(xì)胞脂肪變減輕，胞漿內(nèi)脂滴減少或消失，無明顯炎細(xì)胞壞死或浸潤(rùn)，表明阿魏酸對(duì)肝組織脂肪變性具有良好的改善作用。上述說明阿魏酸干預(yù)不僅可以緩解肥胖的癥狀，改善肝脂肪變性，同時(shí)調(diào)節(jié)了血脂水平，減輕高脂血癥。

腸道菌群在機(jī)體能量和物質(zhì)代謝、營(yíng)養(yǎng)消化吸收、內(nèi)分泌代謝等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可能通過產(chǎn)生膽固醇氧化酶、抑制肝脂肪合成酶的活性及調(diào)節(jié)膽固醇在血液與肝中的分布等多種途徑來調(diào)節(jié)血脂[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌群中厚壁菌數(shù)量升高，擬桿菌降低，阿魏酸干預(yù)可以使厚壁菌數(shù)量降低，擬桿菌升高，F(xiàn)/B(厚壁菌/擬桿菌)比值降低。厚壁菌及擬桿菌在調(diào)節(jié)宿主的內(nèi)分泌代謝，包括碳水化合物、脂肪和膽汁酸代謝中起著重要的作用[10]，在調(diào)節(jié)宿主對(duì)飲食動(dòng)態(tài)變化的反應(yīng)方面具有協(xié)同作用[11]。肥胖小鼠腸道中F/B比值增加，無菌小鼠移植肥胖小鼠腸道菌群后，從食物中獲取能量的能力增加，同時(shí)出現(xiàn)了肥胖[12]。這說明阿魏酸可能通過調(diào)節(jié)厚壁菌和擬桿菌的數(shù)量，影響脂質(zhì)代謝和體重。

在科水平上，阿魏酸可以改善高脂喂養(yǎng)小鼠瘤胃菌科數(shù)量的降低，抑制高脂喂養(yǎng)小鼠韋榮球菌科數(shù)量的增加。瘤胃菌科是一種產(chǎn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)的益生菌，可以降解多種多糖和纖維[13]。此外，瘤胃菌科的豐度與酒精性肝硬化，肝性腦病，非酒精性脂肪性肝病以及腸道通透性增加呈顯著負(fù)相關(guān)[14-17]。韋榮球菌科為條件致病菌，韋榮球菌科的數(shù)量受脂肪攝入的影響，可能參與了肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂[18]。在屬水平上，阿魏酸組改善了高脂喂養(yǎng)小鼠Odoribacter數(shù)量的降低。有研究表明，Odoribacter的豐度與肥胖、收縮壓和纖溶酶原激活物抑制劑-1水平呈負(fù)相關(guān)，且與心血管風(fēng)險(xiǎn)預(yù)防有關(guān)[19-20]。阿魏酸組Lachnospiraceae_UCG-010顯著富集。Lachnospiraceae_UCG-010是產(chǎn)丁酸菌，丁酸對(duì)抗炎癥、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪形成等具有重要意義[21]。

綜上所述，阿魏酸可以改善小鼠的血脂水平及肝脂肪變性情況，調(diào)節(jié)高脂小鼠的腸道菌群，改善高脂血癥。研究證實(shí)，腸道菌群參與高脂血癥發(fā)病的機(jī)制是復(fù)雜的、多因素的，要明確阿魏酸改善高脂血癥的具體作用靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。近30年來，阿魏酸在心腦血管疾病臨床上得到廣泛應(yīng)用，未來可能成為預(yù)防或抑制肥胖、糖尿病、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等一系列疾病的潛在藥物。