斑馬魚功效模型在驗證乳制品補(bǔ)鈣和促進(jìn)腸蠕動中的應(yīng)用

蔣一之，朱曉宇，李露露,，俞航萍，榮佳，李春啟,,3*

(1. 南京新環(huán)檢測科技有限公司，南京 210032； 2. 杭州環(huán)特生物科技股份有限公司， 杭州 310051；3. 浙江省人用物品安全性評價技術(shù)研究重點實驗室早期評價基地， 杭州 310053)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，乳制品市場的逐漸擴(kuò)大，牛奶和酸奶成為了非常受歡迎的飲品。消費者在選擇牛奶和酸奶品質(zhì)除去口味營養(yǎng)，還會關(guān)注牛奶的補(bǔ)鈣和酸奶促進(jìn)腸胃蠕動這兩方面。因此評價牛奶和酸奶的品質(zhì)有必要引入生物學(xué)評價，通過生物指標(biāo)能直觀反映產(chǎn)品的營養(yǎng)等品質(zhì)。

斑馬魚是一種新型的實驗動物，與傳統(tǒng)小鼠相比，斑馬魚實驗速度快、高效、低成本[1]。斑馬魚體積小，發(fā)育快，且和人類具有高度同源性，有相似的器官、生理功能和信號通路[2-3]。斑馬魚生物學(xué)評價能夠完善現(xiàn)有的食品檢測技術(shù)和品質(zhì)評價體系方法，為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的篩選和評價提供了一種新方法。

鈣黃綠素是一種熒光染料，與體內(nèi)鈣離子結(jié)合[4]，而骨骼主要是有鈣化結(jié)構(gòu)組成[5]，可用于檢測斑馬魚骨骼鈣水平。同樣是熒光染料尼羅紅在斑馬魚體內(nèi)不被其他組織干擾，并不會被吸收[6]，通過定量斑馬魚胃腸道內(nèi)的尼羅紅可評價促腸蠕動作用。本研究以斑馬魚前3根椎骨的熒光強(qiáng)度和腸道內(nèi)尼羅紅的熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，快速評價純牛奶補(bǔ)鈣和酸奶促進(jìn)腸道蠕動功能，為牛奶和酸奶品質(zhì)的生物學(xué)評價提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗用斑馬魚為野生型AB品系斑馬魚，胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進(jìn)行。胚胎置于標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中(標(biāo)準(zhǔn)稀釋水：294.0 mg/L CaCl2·2H2O、123.3 mg/L MgSO4·7H2O、63.0 mg/L NaHCO3和5.5 mg/L KCl)，在28℃ 條件下孵化。本研究實驗單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司已獲得實驗動物使用許可證【SYXK(浙)2012-0171】，并通過國際AAALAC認(rèn)證(001458)。

1.1.2 試劑與儀器

甲基纖維素(079K0054 V， Sigma)；6孔板(090119BA01，Nest)；尼羅紅Nile Red(N3013-100MG，Sigma)；鈣黃綠素(MKCH3930， Sigma)；DMSO(BCBT0803，Sigma)；A、B兩個品牌的純牛奶(A0、A1、A2、B0、B1和B2，其中A0和B0為普通純牛奶，A1和B1為高鈣牛奶，A2和B2為高端純牛奶)、酸奶(A3、A5、A6、B3、B5和B6)和乳酸菌飲料(A4和B4)(購于世紀(jì)聯(lián)華江暉路店，杭州)；熒光顯微鏡(AZ100，Nikon)；與顯微鏡相連的相機(jī)(TK-C1481EC，Nikon)；精密電子天平(cp214，OHAUS)。

1.2 方法

1.2.1 純牛奶LC10、LC50和最大耐受濃度(maximum tolerable concentration，MTC)測定

隨機(jī)選取930尾發(fā)育健康且階段一致的3 dpf斑馬魚于六孔板中，每孔30尾。分別加入濃度為10、14.3、20.1、28.4和40 mg/mL的6種牛奶稀釋液(標(biāo)準(zhǔn)稀釋水稀釋)，每孔3 mL，每天換液，處理96 h，同時設(shè)置正常對照組(標(biāo)準(zhǔn)稀釋水處理組)。實驗結(jié)束后，統(tǒng)計各實驗組斑馬魚死亡數(shù)量，用OriginPro 8軟件擬合，計算LC10、LC50和MTC。

1.2.2 牛奶補(bǔ)鈣效果評價

隨機(jī)選取570尾發(fā)育健康且階段一致的3 dpf的野生型斑馬魚于6孔微孔板中，每孔30尾，分別暴露于MTC/4、MTC/2和MTC的6種純牛奶稀釋液中，同時設(shè)置正常對照組；樣品處理斑馬魚至7 dpf，使用2 mg/mL鈣黃綠素染色。染色后，每實驗組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚，在顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，計算斑馬魚前3根椎骨的熒光強(qiáng)度(S)，補(bǔ)鈣作用的計算公式如下：

1.2.3 酸奶和乳酸菌飲料MTC測定

隨機(jī)選取1230尾發(fā)育健康且階段一致的6 dpf斑馬魚于六孔板中，每孔30尾。分別加入濃度為10、14.3、20.1、28.4和40 mg/mL的8種酸奶稀釋液，每孔3 mL，處理24 h，同時設(shè)置正常對照組。實驗結(jié)束后，統(tǒng)計各斑馬魚死亡數(shù)，用OriginPro 8軟件擬合，計算LC10、LC50和MTC。

1.2.4 酸奶和乳酸菌飲料對腸蠕動的促進(jìn)作用評價

隨機(jī)選取750尾受精后5 d(5 dpf)的野生型AB品系斑馬魚，水溶給予尼羅紅16 h建立斑馬魚胃腸動力促進(jìn)劑篩選模型。尼羅紅移除后，將斑馬魚隨機(jī)分配于六孔板中，每孔30尾。分別暴露于MTC/4、MTC/2和MTC的8種酸奶稀釋液中，同時設(shè)置正常對照組。處理24 h后，每實驗組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，計算斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度(S)，腸蠕動的促進(jìn)作用計算公式如下：

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 純牛奶的LC10、LC50和最大耐受濃度(MTC)測定

6種純牛奶的MTC均為10 mg/mL。通過擬合的濃度-致死曲線得到6種純牛奶的相應(yīng)濃度都很相近，LC10為12.9 ～ 14.5 mg/mL，LC50為19.9 ～ 21.2 mg/mL。詳見表1。

2.2 純牛奶補(bǔ)鈣功能評價

A0和A2在10.0 mg/mL濃度下分別引起斑馬魚骨骼中鈣顯著增加1.39倍(P< 0.05)和1.47倍(P< 0.01)，和空白對照組有顯著性差異。其他種類和濃度的純牛奶未引起骨骼鈣的顯著增加(P> 0.05)。詳見表2、圖1、圖2和圖3。

表1 6種純牛奶的LC10、LC50和MTC(n=30)Table 1 LC10, LC50 and MTC of 6 kinds of UHT milk (n=30)

表2 6種純牛奶補(bǔ)鈣評價結(jié)果(n=30)Table 2 Evaluation results of calcium supplementation of 6 kinds of UHT milk (n=30)

注：與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。下表/圖同。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. The same in the following tables and figures.

圖1 6種純牛奶處理斑馬魚后各組斑馬魚脊椎骨熒光強(qiáng)度總和Figure 1 Total fluorescence intensity of vertebrae of zebrafish in each group after treatment with 6 kinds of UHT milk

圖2 6種純牛奶處理斑馬魚后各組斑馬魚骨骼中鈣增加倍數(shù)Figure 2 Increase of calcium in zebrafish bones of each group after 6 UHT milk treatments

圖3 6種純牛奶處理斑馬魚后最高濃度組斑馬魚骨骼中熒光強(qiáng)度對比Figure 3 Comparison of fluorescence intensity in the bones of zebrafish treated with 6 kinds of UHT milk at the highest concentration

2.3 酸奶和乳酸菌飲料的LC10、LC50和MTC測定

8種酸奶和乳酸菌飲料的MTC均為10 mg/mL。通過擬合的濃度-致死曲線得到酸奶和乳酸菌飲料的相應(yīng)濃度都很相近，LC10為12.7 ～ 15.6 mg/mL，LC50為18.9 ～ 21.1 mg/mL。詳見表3。

2.4 酸奶和乳酸菌飲料對腸蠕動促進(jìn)作用評價

實驗組斑馬魚的腸道熒光信號強(qiáng)度平均值均顯著低于空白對照組(P> 0.05)，說明酸奶和乳酸菌飲料均促進(jìn)斑馬魚腸道蠕動。A3和B3為常溫酸奶，A4和B4為冷藏乳酸菌飲料，這兩組內(nèi)不同品牌同類酸奶和乳酸菌飲料對腸蠕動的促進(jìn)作用沒有顯著性的差異(P> 0.05)。A5、B5、A6和B6四種冷藏酸奶中，A5、B5和B6三種酸奶間腸蠕動促進(jìn)作用不存在顯著性差異(P> 0.05)，但是作用都顯著優(yōu)于A6酸奶(P< 0.001)。同品牌內(nèi)不同酸奶和乳酸菌飲料促進(jìn)腸蠕動作用存在差異，A5 > A3 > A6 > A4，B5 > B3 > B6 > B4，兩款常溫酸奶作用都介于同品牌的兩種冷藏酸奶中間；兩款乳酸菌飲料的作用均顯著差于酸奶(P< 0.001)。(見表4,圖4、5、6)

表3 8種酸奶和乳酸菌飲料的LC10、LC50和MTC(n=30)Table 3 LC10, LC50 and MTC of 8 kinds of yogurt and lactobacillus beverage (n=30)

圖4 8種酸奶和乳酸菌飲料處理斑馬魚后各組斑馬魚腸道熒光信號強(qiáng)度Figure 4 Intestinal fluorescent signal intensity of zebrafish in each group after treatment with 8 yoghurt and lactobacillus beverage

表4 8種酸奶和乳酸菌飲料腸蠕動促進(jìn)作用評價實驗結(jié)果(n=30)Table 4 Evaluation results of 8 kinds of yogurt and lactobacillus beverage for promoting intestinal peristalsis (n=30)

圖5 酸奶和乳酸菌飲料處理后斑馬魚腸道內(nèi)熒光強(qiáng)度變化Figure 5 Changes of intestinal fluorescence intensity of zebrafish treated with yoghurt and lactobacillus beverage

圖6 8種酸奶和乳酸菌飲料對斑馬魚腸道腸蠕動的促進(jìn)作用Figure 6 Effects of 8 kinds of yoghurt and lactobacillus beverage on intestinal peristalsis of zebrafish

3 討論

牛奶中鈣的存在形式主要是乳鈣，其主要成分是磷酸鈣[7]。乳鈣被認(rèn)為是容易消化吸收并且營養(yǎng)價值最好的鈣來源[8-9]。普通純牛奶和高端純牛奶在加工過程中沒有添加其它物質(zhì)，鈣全部來源于生牛乳，而高鈣牛奶中的乳鈣因為添加的碳酸鈣等破壞了原有的平衡而析出[10-11]，雖總體鈣含量增加，但吸收利用度高的乳鈣減少，可能高鈣牛奶的補(bǔ)鈣效率并沒有優(yōu)于普通純牛奶。

研究表明酸奶和乳酸菌飲料具有促進(jìn)腸道蠕動的作用[12-15]，與本次實驗的結(jié)果相同，所有酸奶和乳酸菌飲料均有促進(jìn)了腸道蠕動作用，但酸奶明顯優(yōu)于乳酸菌飲料，且活菌數(shù)量很少的常溫酸奶和冷藏酸奶作用相近。用于酸奶和乳酸菌飲料加工的雙歧桿菌、乳酸菌等菌種屬于腸道有益菌，有益菌和其代謝產(chǎn)物都能改善腸道功能，促進(jìn)腸道蠕動[16]。

實驗對純牛奶補(bǔ)鈣以及酸奶和乳酸菌飲料促進(jìn)腸蠕動兩方面進(jìn)行了生物學(xué)評價，結(jié)果與一般消費者的想法存在差別，但是同時是能夠指導(dǎo)消費者進(jìn)行正確選擇。不同純牛奶、酸奶和乳酸菌飲料作用的差別只進(jìn)行了簡短的討論，需要后續(xù)實驗進(jìn)行更深入的研究。