高尿酸血癥鵪鶉腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

黃勝男，林志健，張冰*，呂錦濤，王如然

(1. 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院南區(qū)，北京 102618； 2. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是尿酸生成過多和/或排泄減少導致的一種代謝紊亂疾病。近年來，研究顯示它與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，例如，新疆維吾爾族和漢族高尿酸血癥患者與尿酸正常人群腸道優(yōu)勢菌屬有顯著差異，高尿酸血癥患者糞便中毛螺旋菌科Roseburia屬、乳酸菌多于正常人群[1]。腸道菌群是人體不可或缺的一部分，參與機體物質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)，菌群結(jié)構(gòu)改變可引發(fā)代謝紊亂疾病[2]。本課題組前期采用高嘌呤飲食誘導鵪鶉高尿酸血癥模型(禽類與人類一樣缺乏尿酸酶，嘌呤類物質(zhì)在體內(nèi)降解后終產(chǎn)物為尿酸)，研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥鵪鶉伴有腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，廣譜抗菌藥物可抑制該病理過程[3]。在此基礎上，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)分析高尿酸血癥鵪鶉腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，為高尿酸血癥病理機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

普通級迪法克鵪鶉20只，雄性，5周齡，體重(150 ± 15)g，購自北京市種禽場德嶺鵪鶉分廠【SCXK(京) 11011360218082】，檢疫合格證號: 1100546039。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學普通級動物實驗室【SYXK(京) 2016-0038】。飼養(yǎng)條件：晝夜各半循環(huán)照明，溫度20 ～ 25℃，相對濕度40% ～ 60%。所有操作均符合北京中醫(yī)藥大學科學實驗倫理學要求(倫理審查證號：1100000010039)。

1.1.2 試劑與儀器

酵母干粉(批號：1213550，英國OXOID公司生產(chǎn))；QIAamp DNA Stool Mini Kit(貨號：51504，德國Qiagen公司生產(chǎn))；Poly-Gel DNA Extraction Kit(貨號：D2561-02，美國OMEGA 公司生產(chǎn))。16 s rRNA V3區(qū)擴增引物(上游341F：5′-CGCCCGGGGCG CGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′；下游518R：5′-ATTACCGCG GCTGCTGG-3′)[4]由上海生工生物工程公司合成。變性梯度凝膠電泳儀 (Bio-Rad，美國)；全自動生化分析儀(BECKMAN，美國)；PCR儀(Biometra，德國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

將鵪鶉按體重隨機分為正常組和模型組，每組10只。正常組給予普通飼料，模型組給予高嘌呤飼料[普通飼料∶酵母=3∶1，每日喂食酵母15 g/(kg·d)]，再補充普通飼料，兩組均自由飲水[5]。每7天頸靜脈取血1次，分離血清，-80℃保存，取血前禁食不禁水12 h；實驗第28天，取血后自由飲水飲食，次日處死，取盲腸內(nèi)容物，-80℃保存；取盲腸遠端1 cm處小段盲腸組織，置于4%多聚甲醛固定。

1.2.2 尿酸含量檢測

全自動生化儀檢測實驗第0天、第7天、第14天、第21天、第28天血清尿酸含量。

1.2.3 細菌DNA提取

精密稱取盲腸內(nèi)容物0.2 g，按照 QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書提取各樣本總DNA，-20℃保存。

1.2.4 PCR-DGGE電泳

PCR擴增：采用細菌通用引物GC-338F和518R為上、下游引物，擴增樣品16S rRNA 基因V3可變區(qū)，擴增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL，上、下游引物(濃度均為20 mmol/L)各1 μL，rTaq(5 U/μL)0.4 μL，DNA模板1 μL，補ddH2O至50 μL。擴增條件：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min，退火55℃ 45 s；延伸72℃ 1 min，30個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。采用8%的聚丙烯酰胺凝膠配制35%～55% DGGE變性梯度凝膠，其中含化學變性劑100%尿素7 mol/L、40%(V/V)丙烯酰胺，上樣10 μL PCR產(chǎn)物，在1×TAE緩沖液中150 V 60℃下電泳5 h，銀染法染色，Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)拍照留圖[6]。

1.2.5 差異條帶分析

滅菌手術(shù)刀切下DGGE圖譜中兩組差異條帶，應用Poly-Gel DNA Extraction Kit試劑盒回收DNA片段，以回收產(chǎn)物為模板進行PCR擴增：分別以338F、518R為上、下游引物；擴增體系為10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL，上下游引物(20 mmol/L)各1 μL，rTaq(5 U/μL)0.4 μL，DNA模板1 μL，補ddH2O至50 μL；擴增程序為預變性94℃ 4 min，變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30個循環(huán)，最終72℃延伸10 min。再切膠回收DNA片段，經(jīng)純化后，連接到Pmd18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行序列測定，將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，Blast程序進行同源性比較[7]。

1.2.6 盲腸組織病理

二甲苯常規(guī)脫蠟，乙醇梯度回水，蘇木精染液染色，流水洗去玻片上多余蘇木精液，1%鹽酸-乙醇分色，水洗，氨水返藍，流水沖洗，0.5%伊紅液染色，蒸餾水稍洗；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片[8]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 鵪鶉血尿酸水平比較

與正常組比較，模型組鵪鶉在實驗第7天、第14天、第21天、第28天血尿酸水平顯著升高(P< 0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 細菌16S rDNA PCR擴增

細菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，得到約200 bp的DNA片段(圖1)，用于DGGE分析。

表1 鵪鶉血尿酸水平比較Table 1 Serum uric acid in

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the normal group，*P< 0.05.

注：1-6為正常組；7-12為模型組；M為DNA marker。圖1 16S rRNA V3區(qū)通用引物GC-338F/518R擴增產(chǎn)物電泳圖Note. 1-6，Normal group. 7-12，Model group. M, DNA marker.Figure 1 Electropherogram of amplification products of universal primers GC-338F/518R in V3 region of 16S rRNA

2.2.2 PCR產(chǎn)物的DGGE電泳分析

DGGE電泳圖譜見圖2，Quantity One軟件對條帶位置和亮度進行數(shù)據(jù)化處理和UPGMA相似性聚類分析。與正常組比較，正常組1-6號樣品豐度分別為38、40、36、35、38、34；模型組7-12號豐度分別為34、29、28、31、36、32，模型組豐度小于正常組；UPGMA相似性聚類分析結(jié)果顯示，正常組1、3、5可以聚為一類，相似系數(shù)為61%，2、4、6聚為一類，相似系數(shù)為66%；模型組7、8、10、11、12可以聚為一類，相似系數(shù)為66%。說明正常組和模型組各樣品中菌群結(jié)構(gòu)有較大的差異，除了9號樣品，其余樣品可根據(jù)菌群結(jié)構(gòu)相似性區(qū)別出正常組和模型組。

2.2.3 差異條帶序列分析

采用logistic回歸分析方法篩選出兩組鵪鶉DGGE電泳圖譜12條差異性條帶，切膠、回收、克隆測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中微生物同源性進行比對，結(jié)果見表2。利用MEGA 6.0軟件對差異條帶進行系統(tǒng)發(fā)育學分析：差異條帶歸屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)三大類，見圖3。有7種同源性大于93%的細菌，分別為厚壁菌門Megamonasrupellensis、Megamonashypermegale、Faecalibacteriumprausnitzii、Clostridiumpopuleti，擬桿菌門Bacteroidescoprocola、Prevotellahisticola和變形菌門Anaerobiospirillumsucciniciproducens。

2.3 盲腸組織病理分析

40倍鏡下可見模型組鵪鶉盲腸皺襞變平，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，200倍鏡下可見隱窩內(nèi)炎細胞分布，提示炎性變化(如箭頭所示)，見圖4。

注：1-6為正常組；7-12為模型組。圖2 細菌16S rDNA PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖譜(A)和UPGMA相似性聚類分析(B)Note. 1-6，Normal group. 7-12，Model group.Figure 2 DGGE electrophoretogram of bacterial 16S rDNA PCR products (A)and UPGMA similarity cluster analysis (B)

表2 DGGE圖譜中差異條帶的序列分析
Table 2 Sequence analysis of differential bands in DGGE diagram

圖3 DGGE差異條帶系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogentic tree of DGGE differential bands

注：A： 正常組(×40)；B： 模型組(×40)；C： 正常組(×200)；D： 模型組(×200)。箭頭：隱窩內(nèi)炎細胞。圖4 鵪鶉盲腸病理切片Note. A, Normal Group(×40). B, Model Group(×40). C, Normal Group(×200). D, Model Group(×200). The arrow：Inflammatory cells in the crypt.Figure 4 Pathological sections of the cecum of quail

3 討論

腸道菌群是人體不可或缺的一部分，早在上世紀初就有腸道菌群益生作用的記載，它參與人體代謝和免疫調(diào)節(jié)。近年來研究報道，痛風患者(以血尿酸升高為生化基礎)與健康對照人群比較，其腸道菌群組成和分布上存在顯著差異[9]；維吾爾族、漢族人群中正常人與高尿酸血癥患者腸道優(yōu)勢菌屬有顯著差異[1]；實驗研究顯示，外源性補充酪酸梭菌可在一定程度上降低大鼠血尿酸[10]；釀酒酵母菌影響宿主自身免疫促進嘌呤分解，使尿酸生成增多[11]，這些研究提示高尿酸血癥的發(fā)生可能跟某些腸道菌群有關(guān)。本研究采用高嘌呤飲食誘導鵪鶉高尿酸血癥，模擬臨床上飲食不節(jié)導致血尿酸水平升高，探討該狀態(tài)下腸道菌群結(jié)構(gòu)變化特點，為從調(diào)節(jié)腸道菌群視角治療高尿酸血癥提供參考。

研究結(jié)果顯示，高嘌呤飲食喂飼鵪鶉，在造模第7天、第14天、第21天、第28天，其血尿酸水平較正常組鵪鶉顯著升高(P< 0.05)，造模第28天，盲腸內(nèi)容物中菌群豐度降低；從DGGE圖譜及其差異條帶序列分析可以看出，發(fā)生改變的菌群主要是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，模型組鵪鶉Bacteroidescoprocola、Prevotellamaculosa、Clostridiumpopuleti、Prevotellahisticola等12種細菌優(yōu)勢度改變。Bacteroidescoprocola、Prevotellamaculosa、Prevotellahisticola歸屬于擬桿菌門，革蘭陰性厭氧桿菌，可參與降解多糖，產(chǎn)生乙酸、丁酸和琥珀酸[12]；Clostridiumpopuleti歸屬于厚壁菌門，革蘭陽性厭氧菌，也是腸道內(nèi)常見的纖維降解菌，產(chǎn)生乙酸和丁酸[13]。研究表明，菌群代謝產(chǎn)物乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)參與能量代謝，抑制炎癥因子釋放，增強黏膜屏障及免疫功能，增加尿酸腸道排泄[14-15]。擬桿菌屬對機體也有致病性，其代謝產(chǎn)生內(nèi)毒素(endotoxin，LPS)可誘導炎癥反應，往往伴有尿酸生成關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)活性增加，使尿酸產(chǎn)生增多[16-17]。本研究中，觀察到模型組鵪鶉盲腸隱窩結(jié)構(gòu)紊亂及炎性改變，腸道屏障受損，該病理過程可能跟腸道菌群結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，是影響尿酸腸道排泄的因素之一[14]。

研究方法上，由于腸道細菌以厭氧菌為主，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法需專門的厭氧培養(yǎng)環(huán)境，實驗操作繁瑣，且傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)計數(shù)技術(shù)僅能反映腸道菌群數(shù)目變化，不能反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和種群變化。本研究采用PCR-DGGE方法可簡單快速研究菌群結(jié)構(gòu)及種群變化[18-19]，具有靈敏度高、重復性好等優(yōu)點。當然，該方法只能鑒別出數(shù)量大于1%的優(yōu)勢菌群的存在，而腸道還存在其他很多微生物，數(shù)量占比雖小(如雙歧桿菌)，但對機體產(chǎn)生了重要作用[20]。因此，在后續(xù)的研究中，需采用16 s測序或宏基因組測序法對腸道菌群進行深度分析，明確腸道菌群與高尿酸血癥之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系及可能機制。