生物錳氧化物聚集體對染料的脫色性能研究*

張 震，丁 涵，楊朋坤

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽業(yè)協(xié)會）

紡織染料是一類種類豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)品，通常包括偶氮類、蒽醌類、靛酚、三芳甲烷和雜環(huán)類等多種類型。工業(yè)廢水中殘留的紡織染料的去除已經(jīng)成為水污染治理領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。生物方法處理染料殘留的機(jī)制是利用生物產(chǎn)生的酶降解染料。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以降解紡織染料的酶有木質(zhì)素酶過氧化物酶、偶氮還原酶、錳過氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶等。這些酶都是通過對染料特定基團(tuán)的氧化還原作用對染料進(jìn)行脫色的。其中研究較多的是漆酶。漆酶是一類可以氧化多種芳香族化合物的多銅氧化酶，其底物廣泛，包括芳香族化合物，ABTs，金屬離子等。從白腐真菌（P. ostreatus）提取的漆酶粗酶對Remazol Brilliant Blue R（RBBR）蒽醌染料的最大脫色效率可達(dá)70%，將酶液固定在藻酸銅珠上可以提高酶的重復(fù)利用次數(shù)。而真正的工業(yè)廢水中通常是幾種染料混合存在，關(guān)于混合染料的脫色報(bào)道還不多。最近利用表面展示技術(shù)將細(xì)菌漆酶錨定在惡臭假單胞菌表面構(gòu)建成重組菌，重組菌對蒽醌類染料酸性綠25 的最大脫色效率為97%，對偶氮類染料酸性紅AR18 的脫色率達(dá)到89%。對混合染料的脫色也有同樣的效果，而且這種重組菌可以重利用。

錳氧化物是一種具有強(qiáng)氧化性的氧化劑。化學(xué)合成的β-MnO2納米棒在酸性條件下無須過氧化氫即可催化降解堿性桃紅染料，常溫條件下，pH 值在1 左右時(shí)，反應(yīng)90min后染料溶液脫色率達(dá)87%；納米結(jié)構(gòu)的ε-MnO2可以用于催化分解苯酚；納米結(jié)構(gòu)的β-MnO2催化降解羅丹明B（Rh B）的降解率為75%；δ-MnO2氧化降解雙酚A的去除率即可達(dá)到99%。

雖然生物和化學(xué)的方法都可以降解染料，但是都有其局限性。生物的方法降解染料一般都是只針對一種染料或一類染料，而且單純的酶的重復(fù)利用性比較差，將酶固定在納米載體上會導(dǎo)致成本升高。純粹的化學(xué)降解方法成本高，而且降解率較低。

該實(shí)驗(yàn)室從畜禽廢水中分離得到的一株假單胞菌MYZ68，既可以氧化Mn（II）生成錳氧化物，又具有全細(xì)胞漆酶活性，在氧化Mn（II）的同時(shí)細(xì)菌可以和錳氧化物形成聚集體。該研究利用聚集體同時(shí)具有的漆酶氧化活性和錳氧化物的氧化活性及吸附性對復(fù)合紡織染料廢水進(jìn)行脫色研究，并檢測其重復(fù)利用率。

1 材料和方法

1.1 材料

假單胞菌MYZ68 為河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院保存，分離自河南盧氏錳礦場表層土壤。LBB 和ABTs 購買自美國Sigma-Aldrich公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。Lept培養(yǎng)基，30℃，搖床（150 r/min）培養(yǎng)細(xì)菌。含錳培養(yǎng)基中Mn（II）的初始濃度為1 mmol/L。染料溶于0.1 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）配制成10 g/L的母液備用。

1.2 細(xì)菌全細(xì)胞漆酶活性和錳氧化活性的檢測

漆酶的活性測定以ABTS 為底物在25℃下進(jìn)行。2 mL反應(yīng)體系包括：100 μL 0.5 mM的ABTS，1.7 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH4.0），100 μL 2 mM 的CuCl2和100μL OD600=1.0 用PBS 重懸的全細(xì)胞菌液（收集細(xì)胞后，用PBS洗滌3次）。測定420 nm下的吸光度值。1個(gè)單位的酶活定義為每分鐘氧化1 umol的ABTS所需的酶量。酶活測定及計(jì)算方法參照Bourbonnais 等（Bourbonnais and Paice,1990）描述修改進(jìn)行。

LBB法測定細(xì)菌的錳氧化活性：挑取細(xì)菌單菌落于培養(yǎng)基中，按照0.5%～1%的接種量轉(zhuǎn)接到含錳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集1 mL 菌體（12000 r/min,30 s），棄上清，加入50 μL Hepes（10mM），混勻，按1∶5（V∶V）加入0.04%LBB 溶液，避光反應(yīng)約10 min。反應(yīng)后，離心（12000 r/min,30 s），取上清測定吸光值（620 nm）。根據(jù)高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算錳氧化物濃度（Zhang et al.,2015）。

1.3 染料脫色實(shí)驗(yàn)

5 mL 反應(yīng)體系包括：染料500 μL（終濃度為1g/L），3.5 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液，1 mL用PBS重懸的聚集體（收集培養(yǎng)48h的聚集體后，用PBS洗滌3次），反應(yīng)體系處于25℃。150 r/min搖床中脫色24 h，每1 h取一次樣品，在染料的最大吸收波長處用紫外-可見分光光度計(jì)測得脫色率?？瞻讓φ諏?shí)驗(yàn)在不加細(xì)菌聚集體的相同條件下進(jìn)行。所有測量均重復(fù)三次取平均值。

脫色率公式為：脫色率（%）=（A0-A）/A0100%

A0—染料的初始吸光度值

A—經(jīng)過漆酶處理后染料的吸光度值

1.4 持續(xù)脫色實(shí)驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)所用的聚集體在最適條件下處理染料，這稱之為第一輪脫色。離心收集第一輪脫色的脫色產(chǎn)物，在同樣條件下再脫色染料。這稱之為第二輪脫色。然后離心收集第二輪脫色的脫色產(chǎn)物在含Mn（II）的Lept培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，離心收集聚集體，在最適條件下脫色染料，這稱之為第三輪脫色。分別計(jì)算三輪脫色實(shí)驗(yàn)的脫色率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌MYZ68的全細(xì)胞漆酶活性和錳氧化活性

本研究檢測了MYZ68在生長過程中全細(xì)胞漆酶活性和Mn（II）氧化活性的變化。MYZ68 在含1mmol/L 濃度的LEPT培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，每4 h取樣檢測其全細(xì)胞漆酶活性和錳氧化物濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 MYZ68生長過程中的全細(xì)胞酶活和錳氧化活性變化曲線

結(jié)果顯示，MYZ68 在生長12 h 后全細(xì)胞漆酶活性達(dá)到最高，約45 U/mL，而后隨著時(shí)間的延長，漆酶活性逐漸降低，在28 h時(shí)漆酶活性逐漸穩(wěn)定，約35 U/Ml。MYZ68形成的錳氧化物濃度在28 h 時(shí)達(dá)到最高，大約95%以上的Mn（II）已經(jīng)被氧化為Mn（IV）。漆酶是形成錳氧化物聚集體的關(guān)鍵酶，與游離的漆酶相比，存在于錳氧化物聚集體中的漆酶活性保留的時(shí)間更長。

2.2 聚集體對染料進(jìn)行脫色的影響因子分析

利用聚集體對四種染料進(jìn)行了脫色研究，分別是偶氮類 染 料 酸 性 紅18（Acid Red 18，AR18）和 活 性 黑5（Reactive Black 5，RB5）、芳基甲烷類染料堿性黃2（Basic Yellow 2，BY2）以及蒽醌類染料酸性綠25（Acid Green 25，AG25）。分別檢測了時(shí)間、pH值、溫度和金屬離子對聚集體降解這四種染料的影響。

結(jié)果顯示，聚集體在10 min時(shí)對各種染料的脫色即達(dá)到一定程度，在40 min時(shí)達(dá)到最大脫色效果，1 h左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。聚集體對偶氮類染料的脫色性能最好，脫色率可達(dá)95%以上。對芳基甲烷類染料堿性黃的脫色效果最差，只有70%左右。

脫色體系的pH值在2.0～4.0之間時(shí)，聚集體對四種染料的脫色綠最高，最高可達(dá)99%。在堿性環(huán)境中，聚集體對染料的脫色率大幅降低。其中偶氮類化合物的脫色率降至55%左右，堿性黃的脫色率最低，只有40%左右。

在25～45 ℃的溫度下聚集體對各種染料的脫色率最高。漆酶的最適溫度在30 ℃左右，這個(gè)溫度范圍漆酶的活性較高，菌體的各種吸附性蛋白也有較高的活性，因此脫色作用較強(qiáng)。在45 ℃時(shí)游離酶的活性逐步降低，但是在聚集體中由于錳氧化物和菌體的保護(hù)，漆酶仍然能夠保持一定的活性，所以聚集體對染料的脫色率也維持在較高水平。隨著溫度的升高，脫色率逐漸下降，到85 ℃時(shí)偶氮類染料的脫色率約75%，AG25 和BY2 的脫色降至65%左右。在85℃時(shí)，酶的活性已經(jīng)喪失，細(xì)菌菌體也極易裂解。

綜上所述，聚集體對染料進(jìn)行脫色的最優(yōu)條件為pH值3.0，25℃，在1h內(nèi)可以完成對染料的脫色，聚集體對偶氮類染料AR18 和RB5 的脫色效果最好，脫色率可達(dá)98%，而對蒽醌類染料AG25 的脫色效果次之，可達(dá)80%，對芳基甲烷類染料BY2的脫色效果最差，但是也有75%的脫色率。經(jīng)過聚集體的脫色作用，含染料的水基本上可以達(dá)到清澈的效果。

2.3 聚集體對復(fù)合染料的脫色

實(shí)際生活中的染料廢水經(jīng)常含有不止一種染料，因此檢測了聚集體對多種染料混合體系的脫色率。在最優(yōu)脫色體系中，分別加入總?cè)玖虾繛?g/L的兩種或三種染料的混合物，測定所加入染料的脫色率。

圖2 聚集體對兩種染料混合體系的脫色作用

結(jié)果顯示，聚集體可以完成對含有兩種染料的水體的脫色，但是其脫色作用相對于單色染料作用過程稍慢，需要1h以上才能達(dá)到效果（圖2）。

2.4 聚集體對染料的循環(huán)降解

脫色材料的重復(fù)利用和可再生性是評價(jià)材料性能的重要標(biāo)準(zhǔn)，本文用三輪脫色試驗(yàn)驗(yàn)證了聚集體的重復(fù)利用和再生性。

結(jié)果顯示，經(jīng)過一次脫色試驗(yàn)后，直接用于脫色試驗(yàn)的效果較差，脫色率低于第一輪，但是仍有初始能力的90%，經(jīng)過簡單的培養(yǎng)后，聚集體恢復(fù)了脫色能力，在第三輪脫色試驗(yàn)中的脫色率與第一輪相當(dāng)。說明該研究所用的MYZ68所形成的聚集體具有良好的再生性和重復(fù)利用能力。

3 討論

錳氧化物作為一種納米顆粒材料，具有很高的氧化活性，可以氧化多種有機(jī)化合物，并可以吸附多種金屬和有機(jī)物。盡管化學(xué)合成的錳氧化物可以完全氧化有機(jī)物，但是都需要極高的溫度（＞300℃）和嚴(yán)格的pH值條件，或需要其他輔助因素。而這些嚴(yán)苛的條件在實(shí)際的應(yīng)用中都是極難完全符合的。特別是在大規(guī)模處理污水樣品時(shí)，簡單、快速、抗逆、廉價(jià)是一種良好的可實(shí)際利用的降解方法所必須具備的條件。

漆酶是一種多銅氧化酶，具有強(qiáng)氧化性，可以降解多種有機(jī)化合物，底物十分廣泛。漆酶對染料進(jìn)行脫色的研究很多，但是多數(shù)研究表明，漆酶對染料的脫色并不充分，這在應(yīng)用中就會造成二次污染，從而限制了漆酶在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，欲在一個(gè)溫和的環(huán)境中徹底去除紡織染料的危害，僅靠漆酶或錳氧化物的氧化等單一的方法難以達(dá)到目的。

錳氧化細(xì)菌在氧化Mn（II）的過程中可以與錳氧化物形成規(guī)則的聚集體。假單胞菌MYZ68在氧化Mn（II）并形成錳氧化物的過程中，與錳氧化物裹挾在一起，而后更多的細(xì)菌再吸附在這個(gè)混合物上，從而形成球型聚集體。在聚集體中MYZ68 的全細(xì)胞漆酶活性可以存留更長時(shí)間，漆酶的降解速度明顯下降。

在錳氧化物聚集體中，細(xì)菌的漆酶和錳氧化物都有極強(qiáng)的氧化活性。同時(shí)，納米級的錳氧化物和細(xì)菌都可以給漆酶提供一個(gè)相對穩(wěn)定的微環(huán)境和支撐，使其在一定程度上免受外界因素的干擾，可以在較長時(shí)間內(nèi)保持活性，并在pH 值3.0～5.0 的范圍內(nèi)都保持一個(gè)相對較高的活性。這比游離的漆酶對pH 的要求要低很多（Shao et al.,2009）。因此，錳氧化物和細(xì)菌的混合體系可以在一個(gè)相對中性的條件下對紡織染料進(jìn)行脫色。漆酶對溫度也比較敏感，錳氧化物和細(xì)菌給漆酶提供的微環(huán)境和支撐使漆酶對溫度的敏感性有所降低，在45℃時(shí)使漆酶依然具有相當(dāng)?shù)幕钚?。而錳氧化物的降解反應(yīng)則需要較高的溫度，溫度越高越有利于其對染料的脫色，所以在高溫時(shí)，聚集體也依然對紡織染料表現(xiàn)了相當(dāng)?shù)拿撋饔谩?/p>

聚集體可以迅速對燃料進(jìn)行脫色，在最適條件下10 min時(shí)對偶氮類染料的脫色率即可達(dá)到95%以上，40 min時(shí)對蒽醌和芳基甲烷類染料的脫色率可以達(dá)到75%以上。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，聚集體這種復(fù)合材料極大地克服了純酶或細(xì)菌、錳氧化物的缺點(diǎn)，同時(shí)揉合了二者的優(yōu)點(diǎn)，對染料的脫色展現(xiàn)出快速和條件溫和的特點(diǎn)。

金屬離子是染料中常用的助劑，對漆酶活性的影響也很大，很多金屬離子在低濃度時(shí)就可以降低漆酶的酶活，而在本實(shí)驗(yàn)中，多數(shù)的金屬離子在低濃度時(shí)對聚集體脫色作用的影響是不顯著的，這可能是細(xì)胞和錳氧化物對漆酶或細(xì)菌有一定的保護(hù)作用，可以降低金屬離子的傷害。同時(shí)，MYZ68 形成的錳氧化物與菌體裹挾在一起，也對漆酶的活性有一定的保護(hù)作用，避免外界條件的侵?jǐn)_。因此，本研究中構(gòu)建的這一新型脫色材料對外界環(huán)境更有抵抗力，可以抵抗較高的溫度和各種金屬離子的影響。

錳氧化物聚集體具有制備簡單、再生過程簡單的特點(diǎn)，只需要簡單的培養(yǎng)就可以制備。這種材料適合大規(guī)模的制備，以用于大量處理水環(huán)境中的染料。而且聚集體的重復(fù)利用性和可再生性良好，使用過的聚集體只要經(jīng)過簡單的培養(yǎng)就可以恢復(fù)活性，很適合大規(guī)模連續(xù)處理水中的染料。漆酶不僅可以對染料進(jìn)行脫色，還可以氧化其他多種物質(zhì)，可以用于有機(jī)物降解等領(lǐng)域，因此錳氧化物聚集體不僅僅是一種染料脫色材料，還有很大的潛力應(yīng)用于廢水綜合處理領(lǐng)域。

4 結(jié)論

該研究所用的細(xì)菌和錳氧化物的聚集體是一種對各種染料，尤其是偶氮類染料具有良好脫色作用的環(huán)境友好型脫色材料，對偶氮類染料的脫色率可達(dá)95%以上，在環(huán)境廢水的綜合治理領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景?！?/p>