內(nèi)源性蛋白酶對魚糜凝膠的影響及其抑制方法研究進展

陳海強,梁鉆好,周愛梅,馮均元,梁鳳雪,余 銘,*

(1.陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東陽江 529566;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;3.廣東省食品低溫加工工程技術(shù)研究中心,廣東陽江 529566;4.廣東浩洋速凍食品有限公司,廣東陽江 529566)

魚糜制品主要是采用白色魚肉[1-2]經(jīng)多次漂洗、脫水、擂潰成型,再煮制而成的高蛋白低脂肪水產(chǎn)食品[3]。衡量魚糜蛋白的指標主要有保水性、粘著性、乳化性以及凝膠特性,其中最主要的是凝膠特性[4]。但長期以來,凝膠劣化現(xiàn)象一直是困擾魚糜制造商的一大難題[4-5],使其無法滿足消費者對高品質(zhì)魚糜制品的需求。肌原纖維蛋白,尤其是肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MHC)的降解被認為是凝膠劣化的主要原因,而肌原纖維蛋白的降解主要是由水產(chǎn)品的內(nèi)源性蛋白酶引起的[6-8]。

與哺乳動物不同,水產(chǎn)動物體內(nèi)含有豐富的內(nèi)源性蛋白酶,且活性更高[9-11],其對蛋白水解進而影響魚糜等其它產(chǎn)品的加工品質(zhì)的作用[12]不容忽視。根據(jù)國內(nèi)外大量研究顯示,造成魚糜制品凝膠劣化的內(nèi)源性蛋白酶主要是鈣蛋白酶[13]、組織蛋白酶[14-16]、肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶[17-20]。本文概述了這三大類內(nèi)源性蛋白酶的性質(zhì)及其對魚糜凝膠特性的影響,并對抑制劑及其它加工方法進行討論,為魚糜生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 鈣蛋白酶

1.1 鈣蛋白酶的性質(zhì)

鈣蛋白酶(Calpain)是一種依賴鈣離子的蛋白酶,沒有鈣離子結(jié)合時以異二聚體的酶原方式存在,無蛋白分解能力,當與鈣離子結(jié)合時酶原形式被激活,開始分解蛋白。根據(jù)所需鈣離子濃度可分為μ-Calpain級和m-Calpain級[21]。鈣蛋白酶是一種中性半胱氨酸內(nèi)肽酶,pH6.5～7.5時會縮短魚肉的貨架期,加速魚肌肉軟化,影響魚肉制品品質(zhì)[12,22],最佳作用溫度為6 ℃,即使2～4 ℃低溫條件下仍保留一定的活性[12,23]。

1.2 鈣蛋白酶對魚糜凝膠特性的影響

鈣蛋白酶對肌肉蛋白的早期降解起重要作用[24-25]。骨骼肌的鈣蛋白酶存在于肌細胞內(nèi)部,富集在Z帶附近,其特點是可降解原肌球蛋白、肌鈣蛋白、肌間線蛋白、肌聯(lián)蛋白等,但不能降解α-肌動蛋白、α-輔肌動蛋白和肌球蛋白重鏈(MHC)[9]。由于不能水解MHC,Calpain并不直接參與魚糜凝膠劣化,但它對魚肉肌原纖維Z帶的降解[26],尤其是魚死后的最初的24 h[27],會增加肌原纖維蛋白對其它內(nèi)源性蛋白酶的敏感度[22]。具體機理為:Calpain首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)(兩個相鄰Z帶之間的一段肌原纖維)部位,釋放肌絲降解為小片段,這些小片段極容易被溶酶體組織蛋白酶捕獲并進一步降解[28]。另一方面,肌肉蛋白是魚糜制品的天然的乳化器,魚糜制品中95%的保水能力和75%～95%的乳化能力都是源于肌肉蛋白[9],其中又以肌球蛋白的乳化性最好,鈣蛋白酶對肌球蛋白的降解必然會導(dǎo)致魚糜制品的乳化性大大降低,進而影響保水性。再者,鈣蛋白酶通過降解肌聯(lián)蛋白降低魚糜制品的彈性[26]。但有研究把純化的鈣蛋白酶添加到鯖魚肌肉中并制成魚糜,55 ℃、2 h后發(fā)現(xiàn)魚糜破斷力、抗變形能力和凝膠強度均沒有明顯改變[29]。那是因為,通常魚肌肉中高活性鈣蛋白酶往往伴隨有鈣蛋白酶抑制蛋白和其它鈣蛋白酶抑制劑的存在,如鱸魚肌肉中的鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的活性是鈣蛋白酶活性的17倍[30]。

2 組織蛋白酶

水產(chǎn)動物死后溶酶體會破裂并釋放出一種蛋白酶系,稱為組織蛋白酶,可分解肌肉蛋白,表現(xiàn)為水產(chǎn)動物的自溶現(xiàn)象。組織蛋白酶對肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動蛋白、原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白和肌動蛋白等魚肉硬度相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白均具有不同程度的降解能力[31],其中影響魚糜品質(zhì)的主要是半胱氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶B、H、L)[32]和天冬氨酸組織蛋白酶D[31,33]。

2.1 半胱氨酸組織蛋白酶

2.1.1 半胱氨酸組織蛋白酶的性質(zhì) 半胱氨酸組織蛋白酶最大的特點是分子活性中心含有半胱氨酸殘基的活性巰基(-SH),主要包括組織蛋白酶B、組織蛋白酶H和組織蛋白酶L[34],其中組織蛋白酶B和L是引起魚肉質(zhì)構(gòu)劣化的關(guān)鍵內(nèi)源性蛋白酶,組織蛋白酶H在肉類中活性相對較弱,僅為組織蛋白酶B和L的1%[30]。組織蛋白酶B最佳作用pH為6.0,組織蛋白酶L的最佳作用pH為5.0,均為中性或弱酸性條件[12],接近魚糜凝膠形成pH(pH為6.0～8.0),但最佳作用溫度略有差異,組織蛋白酶B為35 ℃[35],組織蛋白酶L為50～60 ℃[36-38]。魚糜從凝膠形成(40～50 ℃)到升溫定型(90 ℃)時正好要經(jīng)過組織蛋白酶最佳溫度段50～60 ℃,容易造成魚糜凝膠劣化,這也是組織蛋白酶L比組織蛋白酶B對魚糜凝膠劣化影響更大的原因之一。

2.1.2 半胱氨酸組織蛋白酶對魚糜凝膠特性的影響 組織蛋白酶B、H、L普遍存在于海水魚和淡水魚的肌動球蛋白中[39],其中組織蛋白酶L的活性最高,而且紅肉魚中的組織蛋白酶L活性總體上比白肉魚高[15],這也是目前魚糜制品原料通常為白肉魚的主要原因之一。組織蛋白酶通過對魚肌肉MHC和其他肌肉纖維蛋白進行不同程度的降解,破壞魚糜凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而削弱魚糜破斷力、抗變形能力、凝膠強度、持水力等多項魚糜凝膠特性,而且與組織蛋白酶B、H相比,組織蛋白酶L在魚糜凝膠劣化中發(fā)揮著更為重要的作用。免疫印跡法證明,魚肉MHC和輔肌動球蛋白極容易被組織蛋白酶降解成低分子蛋白,原肌球蛋白和肌動蛋白對組織蛋白酶L極敏感,肌間線蛋白也可被組織蛋白酶B、L降解[31]。添加了組織蛋白酶B、L的銀鯉魚魚糜凝膠會產(chǎn)生大量氣孔,質(zhì)地松散,魚糜破斷力、抗變形能力和凝膠強度均顯著下降[35],結(jié)合凝膠電泳圖證實了組織蛋白酶可降解肌球蛋白和肌動蛋白[40],使蛋白分子量變小,空間結(jié)構(gòu)松散,形成的魚糜凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不緊致,從而削弱魚糜的持水能力,是造成凝膠劣化的主要酶系之一。組織蛋白L對MHC的降解,在太平洋牙鱈魚魚糜[14]、藍圓鲹魚糜[18]、狹鱈魚魚糜[41]等多種魚糜制品中已得到證實。

2.1.3 抑制由半胱氨酸組織蛋白酶引起的魚糜凝膠劣化的方法

2.1.3.1 添加半胱氨酸蛋白酶抑制劑 由于半胱氨酸組織蛋白酶的分子活性中心為半胱氨酸,因此生產(chǎn)上可通過添加半胱氨酸蛋白酶抑制劑抑制這類蛋白酶活性,可有效阻止其對MHC的降解而引起的魚糜凝膠劣化。E-64是一種典型的半胱氨酸蛋白酶抑制劑,通過與活性半胱氨酸的巰基形成硫醚鍵來起作用,能迅速抑制組織蛋白酶B、H、L的活性,而對絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶沒有影響[42]。而亮抑酶肽是一種較為熟知的既可以抑制半胱氨酸蛋白酶,又可以抑制絲氨酸蛋白酶的可逆性抑制劑[5]。抗痛素(Antipain),又名抗痛素二鹽酸鹽,也能抑制多種半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶,其抑制作用與亮抑酶肽相似。Hu等人[40]從肌動蛋白中提取出純化的組織蛋白酶L并添加到紅色黑鰭大眼鯛魚糜中,在pH5.0和7.0條件下對MHC有顯著的降解作用,2 h后MHC即被完全降解,肌動蛋白也被明顯降解[43]。但添加E-64(0.1 g/kg 肌動球蛋白)后約1 h,只有pH5.0條件下的MHC有輕微降解,說明低濃度的E-64即可明顯抑制MHC的降解。在魚糕制作工藝的二段加熱過程中發(fā)現(xiàn),由于內(nèi)源性蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解,導(dǎo)致凝膠化強度較低,添加組織蛋白酶L后凝膠化強度會進一步下跌,主要原因是MHC幾乎完全被降解,但E-64和亮抑酶肽可有效抑制MHC的降解,使凝膠化強度均有大幅提升,TCA可溶性肽含量也有一定的降幅,說明兩種抑制劑均能明顯抑制魚糜凝膠劣化,但亮抑酶肽對組織蛋白酶L的抑制效果比E-64好[40]。從大部分研究報道來看,E-64、亮抑酶肽(Leupeptin)和抗痛素是三種常用的半胱氨酸蛋白酶抑制劑,可有效抑制由組織蛋白酶B、H、L引起的魚糜凝膠劣化,其抑制效果大小順序為:亮抑酶肽>抗痛素>E-64,同時使用兩種抑制劑可起到增效作用[33,40]。

2.1.3.2 多次漂洗 溶酶體及其釋放的組織蛋白酶存在于肌漿中,因此魚糜制作過程中可通過多次清水或堿水漂洗除去絕大部分可溶性溶酶體組織蛋白酶[17]。大量研究表明,多次漂洗可大大降低魚糜中的組織蛋白酶B、H活性,使凝膠特性得到改善。但并不能完全抑制凝膠劣化,因為漂洗不能除去組織蛋白酶L[14-15],而且漂洗次數(shù)應(yīng)控制在2～3次,否則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失增大,而且魚肉親水膨脹而不容易脫水。如銀鯉魚[16]和太平洋鱈魚[44]經(jīng)3次循環(huán)漂洗后,組織蛋白酶B幾乎喪失活性,而組織蛋白酶L仍然保留有相對較高的活性,表明多次重復(fù)漂洗可除去絕大部分組織蛋白酶B。由此可推斷,與組織蛋白酶B相比,組織蛋白酶L與肌原纖維蛋白結(jié)合的更加緊密,不容易洗脫,從而導(dǎo)致水洗后活性保留率相對較高[45]。

2.2 天冬氨酸組織蛋白酶D

2.2.1 天冬氨酸組織蛋白酶D的性質(zhì) 組織蛋白酶D活性中心含有天冬氨酸殘基[34],合成于細胞的粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并轉(zhuǎn)移到溶酶體中。魚體內(nèi)的組織蛋白酶D在第90和105個氨基酸殘基中缺乏β-發(fā)夾環(huán),因此該酶都是單鏈多肽,分子量為36～40 kDa[46],屬于酸性蛋白酶,在45 ℃[33]、pH2.5～3.7[46]條件下表現(xiàn)出最大活性。

2.2.2 組織蛋白酶D對魚糜凝膠特性的影響 組織蛋白酶D普遍存在于魚體內(nèi)[39],是魚肌肉蛋白降解的關(guān)鍵酶之一,可以水解MHC、肌球蛋白輕鏈、肌動蛋白、輔肌動蛋白、原肌球蛋白,但不能降解肌間線蛋白[31,33,47],組織蛋白酶D對魚糜凝膠劣化的影響比組織蛋白酶B、H、L更大。Godiksen等人[48]通過SDS-PAGE電泳技術(shù)觀察到組織蛋白酶D對17種魚肉肌肉結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(不包括MHC)中的10種有影響,其中9種影響是不利于魚肉質(zhì)構(gòu)的保持,比組織蛋白酶B、L(分別產(chǎn)生4種和2種不利于魚肉質(zhì)構(gòu)的影響)更容易導(dǎo)致肌肉蛋白降解,從而導(dǎo)致魚糜劣化。

2.2.3 抑制由天冬氨酸蛋白酶引起的魚糜凝膠劣化的方法 由于組織蛋白酶D屬于天冬氨酸蛋白酶,魚糜制作過程中可通過添加天冬氨酸蛋白酶抑制劑抑制組織蛋白酶D對魚MHC的降解,從而抑制魚糜凝膠劣化。胃酶抑素A是公認的天冬氨酸蛋白酶抑制劑,在酸性條件(pH3.0,45 ℃)下對魚糜凝膠的影響比任何一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑都要好,可在很大程度上抑制MHC的降解,且同時添加胃酶抑素A和亮抑酶肽后MHC完全沒有降解,這表明魚糜中存在的酸性蛋白酶主要是組織蛋白酶D和半胱氨酸組織蛋白酶,其魚糜TS比單獨添加胃酶抑素A或任何一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑都要高的多(高出27%～42%),而E-64+胃酶抑素A或抗痛素+胃酶抑素A均有類似效果[33],由此表明胃酶抑素A能有效抑制天冬氨酸組織蛋白酶D活性,提高魚糜凝膠特性,配合半胱氨酸蛋白酶抑制劑,即可在極大程度上改善魚糜凝膠特性。Klomklao等人[49]也發(fā)現(xiàn)胃酶抑素A對日本叉牙魚內(nèi)源性酸性蛋白酶的抑制率(89%)是最高的,相比之下,半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E-64、N-乙基馬來酰亞胺、碘乙酸)的抑制效果(<14%)顯得相對較弱,再次證明了組織蛋白酶D對魚糜凝膠劣化的影響比組織蛋白酶B、H、L更大。

3 肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)

3.1 MBSP的性質(zhì)

魚類的肌肉中普遍存在一種肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP),雖然含量少,但與肌肉中的肌原纖維蛋白緊密結(jié)合,且耐熱性強。MBSP的最適溫度和pH為50～55 ℃和7.0～8.0[50-52],這類酶的N-端氨基酸序列和酶特性均與胰蛋白酶非常相似[53],選擇性裂解羧基端(P1位置)的精氨酸殘基,在此基礎(chǔ)上P2位置為脯氨酸殘基的,專一性更強,對P1位置的賴氨酸殘基也有輕微的水解作用,但不水解胰凝乳蛋白酶的專一性底物(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA)[17,53,54],因此也稱為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(Trypsin-like serine proteinase)[17]。MBSP是一種內(nèi)切酶,其活性中心與其他絲氨酸蛋白酶一致,是由Ser195、His57、Asp102氨基酸殘基構(gòu)成[55],堿性(pH8.5～9.5)條件下容易被激活[49,54,56]。

3.2 MBSP對魚糜凝膠特性的影響

MBSP是魚糜制品在50～60 ℃條件下長時間加熱而引起凝膠強度下降的主要原因[18-20,45]。該酶可有效降解肌原纖維中的MHC,對輔肌動蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白也具有不同程度的降解作用,從而導(dǎo)致凝膠強度下降。Cao等人[4]從鯉魚中提取純化得到MBSP,添加到魚糜中,55、60 ℃時魚糜凝膠強度比沒有添加MBSP的分別下降了13%和16.7%。凝膠強度下降不大的原因可能是因為魚肌肉中本身自帶的MBSP對魚糜凝膠已經(jīng)有極大的破壞,在此基礎(chǔ)上,外加的MBSP作用就顯得不明顯;另一個原因可能是與內(nèi)源性MBSP相比,外加的MBSP處于非結(jié)合狀態(tài),與肌原纖維蛋白結(jié)合不緊密,從而影響酶的水解能力。通過蛋白免疫印跡法進一步證明了55～60 ℃時MBSP對MHC、肌動蛋白、輔肌動蛋白和原肌球蛋白均有不同程度的降解。歐洲鯽魚體內(nèi)也被鑒定出存在MBSP,50～60 ℃對MHC有明顯的降解作用,長時間加熱,原肌球蛋白也會被明顯降解,而對其它肌原纖維蛋白(如輔肌動蛋白和肌動蛋白)的降解度較小[17]。也有人認為,MBSP對肌肉MHC和原肌球蛋白的降解較組織蛋白酶L更強,MBSP在120 min后可完全降解MHC,原肌球蛋白完全消失,而組織蛋白酶L處理300 min,MCH的殘留率仍有約50%,而原肌球蛋白僅有輕微的降解[57]。

3.3 抑制由絲氨酸蛋白酶引起的魚糜凝膠劣化的方法

絲氨酸蛋白酶抑制劑可與絲氨酸蛋白酶形成酶-抑制劑復(fù)合物,且結(jié)合緊密,導(dǎo)致水解后續(xù)反應(yīng)速率降低,酶活性受到抑制[58],從而避免由MBSP引起的魚糜凝膠劣化現(xiàn)象。表1列舉了常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用實例。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64對由MBSP引起的MHC的降解也起到相對大的抑制作用,這種現(xiàn)象在鯽魚[17]、鯉魚肌肉[59]的絲氨酸蛋白酶中也有發(fā)現(xiàn),這可能是因為絲氨酸蛋白活性中心附近存在有關(guān)鍵巰基團。另外,目前側(cè)重研究的一些天然的抑制劑,如從魷魚卵巢中提取的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SOSPI),對印度鯖魚[60]和大眼鯛魚[61]的魚糜凝膠均具有良好的保護作用,可有效提高魚糜的破斷力。

表1 常見絲氨酸蛋白酶抑制劑Table 1 Common serine protease inhibitors

4 其他改善魚糜凝膠特性的方法

除了蛋白酶活性中心抑制劑外,一些蛋白質(zhì)、脂類和多糖類等添加物也能起到很好的魚糜凝膠特性改善作用。如水解小麥蛋白通過均勻分布在肌原纖維蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,避免高溫條件下肌原纖維蛋白的相互聚合,從而抑制凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞[62];加入納米魚骨激活內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化交聯(lián)網(wǎng)結(jié)構(gòu),進而影響持水力,提供魚糜制品破斷力[63];山茶油可能通過填充魚糜蛋白基質(zhì)空隙空間或通過提高疏水反應(yīng)和增加β-折疊數(shù)量以堅固凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[64];脫乙基的魔芋葡甘聚糖能夠保護魚糜蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組分在高溫時不被破壞[65],支鏈淀粉在平滑蛋白質(zhì)凝膠基質(zhì)中分布均勻且填滿具有小空隙的魚糜凝膠[66],高溶脹能力的改性淀粉在高溫下形成較高的粘度[67],這些多糖類通過多種方式和機理改善魚糜凝膠特性。

隨著新科技的發(fā)展,超高壓技術(shù)[68-69]、超聲波技術(shù)、輻照技術(shù)、微波加熱等新技術(shù)陸續(xù)用于魚糜加工,而且總體上對魚糜凝膠特性有改善作用[70]。如超高壓技術(shù)通過改變MBSP的蛋白構(gòu)象,影響其活性部位[71];超聲處理改變魚糜肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)變化,提高凝膠強度[70];輻照處理能夠降低α-螺旋含量,提高β-折疊含量[72],有助于熱誘導(dǎo)凝膠化過程魚糜蛋白二硫鍵的形成[73];微波加熱相比傳統(tǒng)的加熱方式,多糖鏈的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會明顯擴展,通過長鏈多糖的空間位阻效應(yīng)阻止蛋白質(zhì)的聚集,增強凝膠網(wǎng)絡(luò)[74]。

5 總結(jié)與展望

魚糜凝膠劣化現(xiàn)狀一直困擾著生產(chǎn)企業(yè)。目前認為魚糜凝膠劣化主要是由魚肌肉中內(nèi)源性蛋白酶引起的,包括鈣蛋白酶、組織蛋白酶B、H、L、D和MBSP。由于鈣蛋白酶往往伴隨有鈣蛋白酶抑制蛋白和其它鈣蛋白酶抑制劑的存在,其對魚糜凝膠劣化影響較小。組織蛋白酶是導(dǎo)致魚糜劣化的主要內(nèi)源性蛋白酶,包括半胱氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶B、H、L)和天冬氨酸組織蛋白酶D。在酸性條件下組織蛋白酶對魚糜凝膠劣化的影響大致順序為組織蛋白酶D>L>B、H,可添加半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制劑加以抑制,此外,多次漂洗工序也可有效抑制肌漿結(jié)合型組織蛋白酶對魚糜凝膠特性的影響。在堿性條件下以MBSP作用對魚糜凝膠劣化影響較為顯著,可考慮添加絲氨酸蛋白酶抑制劑。根據(jù)內(nèi)源性蛋白酶的活性中心選擇適當?shù)囊种苿┦强刂启~糜凝膠劣化的有效方法,此外,添加蛋白質(zhì)、脂類和多糖等天然添加物以及新技術(shù)的應(yīng)用逐漸成為改善魚糜凝膠特性的重要手段。因此,添加內(nèi)源性蛋白酶抑制劑配合其他魚糜凝膠特性改善方法,可有效降低魚糜凝膠劣化及提高魚糜凝膠特性。