發(fā)酵法提取青稞麩皮中β葡聚糖的工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)研究

劉新琦,何先喆,劉潔純,唐慶九,顧飛燕,俞 苓,*

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;3.上海宏度精細(xì)化工有限公司,上海 201108)

青稞(Hordeumvulgare)為禾本科植物,大麥屬[1],具有高蛋白質(zhì)、高膳食纖維、低脂、低糖等特點(diǎn)[2]。青稞由于富含豐富的β-葡聚糖而備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[3]。有研究表明β-葡聚糖具有調(diào)節(jié)血糖[4]、提高免疫力[5-6]、抗腫瘤、抗病毒[7]等功效,除此之外其還具有良好的保濕性[8],可用作保濕化妝品添加劑[9]。

β-葡聚糖常用的提取工藝主要分為三類,分別為水提法[10]、堿提法[11]和酸提法[12]。水提法易操作且提取條件溫和,但β-葡聚糖得率低[13];酸提和堿提法雖使得率有所提高,但要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)pH,而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生大量熱量使實(shí)驗(yàn)難度增加[14]。有報(bào)道在傳統(tǒng)水提工藝的基礎(chǔ)上利用超聲-微波協(xié)同[15]、超高壓[16]等對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,可以進(jìn)一步提高得率,但這些提取方法獲得的β-葡聚糖需要進(jìn)一步純化[17],實(shí)驗(yàn)步驟較長(zhǎng)。發(fā)酵法提取青稞麩皮β-葡聚糖,利用酵母菌豐富的酶系統(tǒng),消耗青稞麩皮中的淀粉和蛋白質(zhì),有效釋放青稞麩皮中β-葡聚糖。另外,由于酵母生長(zhǎng)過(guò)程中不消耗發(fā)酵液中的β-葡聚糖,同時(shí)還能利用還原糖、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)行生長(zhǎng),從而達(dá)到對(duì)β-葡聚糖去雜純化的效果[18],且提高β-葡聚糖得率。目前發(fā)酵法提取β-葡聚糖的報(bào)道只見于燕麥[19],尚未見發(fā)酵法提取青稞β-葡聚糖。因此本文研究了發(fā)酵法提取青稞β-葡聚糖,并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)得到的青稞β-葡聚糖進(jìn)行分離、純化以及理化性質(zhì)分析,為青稞β-葡聚糖的開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青稞麩皮 市售;高活性干酵母、釀酒干酵母、啤酒干酵母、葡萄酒干酵母 均為安琪酵母有限公司,屬釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)類的不同類產(chǎn)品;β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水葡萄糖、牛血清蛋白、酪蛋白、剛果紅、無(wú)水乙醇、考馬斯亮藍(lán)G250、三氯乙酸、活性炭、硅藻土、碘試液 均為國(guó)產(chǎn)分析純,國(guó)藥(上海)化學(xué)試劑有限公司;標(biāo)準(zhǔn)單糖:D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、三氟乙酸 美國(guó)Sigma公司。

L530型離心機(jī)、FD50冷凍真空干燥機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 湘儀儀器公司;UV210紫外分光光度計(jì) 棱光技術(shù)公司;HPLC MALLS索映儀器設(shè)備公司;Waters 2695型高效液相色譜儀、VETEX 70紅外光譜 美國(guó)Waters;DMAX-20射線衍射儀 美國(guó)TA;ICS2500離子色譜儀 Dionex公司;SK-GEL系列凝膠色譜柱G6000PWXL、G4000PWXL(7.8 mm×300 mm) TOSOH。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵法提取青稞麩皮β-葡聚糖 青稞麩皮糊化液的制備:青稞麩皮經(jīng)干燥、粉碎后過(guò)100目篩,將粉碎后的青稞麩皮粉末以一定的料液比加入一定量的水,58 ℃糊化20 min制成青稞糊化液。市售干酵母活化:將市售干酵母加入2%葡萄糖溶液,32 ℃,水浴20 min進(jìn)行活化。在接菌發(fā)酵之前對(duì)青稞糊化液進(jìn)行高溫滅菌121 ℃,20 min[20]。

將青稞糊化液與活化過(guò)的活性干酵母混合攪勻,放入搖床,設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速110 r/min進(jìn)行振蕩發(fā)酵。經(jīng)發(fā)酵后將發(fā)酵液放入離心機(jī),設(shè)置轉(zhuǎn)速4000 r/min離心10 min,收集上清液,緩慢加入3.5倍體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇,并于4 ℃冰箱里醇沉多糖4 h,收集沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥,得到青稞β-葡聚糖粗品。將青稞β-葡聚糖粗品配制成10 mg/mL的溶液,加入5%活性炭,于45 ℃水浴下20 min,再將硅藻土均勻鋪在濾紙上,抽濾除去溶液中的活性炭,收集濾液。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3,通過(guò)真空冷凍干燥得到青稞β-葡聚糖粉末。真空冷凍干燥條件:冷凍溫度為-85 ℃,真空度為0.95 Pa。

1.2.2 水提法提取青稞麩皮β-葡聚糖 參考董磊[21]關(guān)于水提青稞β-葡聚糖條件的優(yōu)化方法并加以改進(jìn)。工藝流程如下:料液比1∶22在52 ℃下提取3 h;4000 r/min離心10 min后取上清液后同1.2.1中實(shí)驗(yàn)方法,得到水提β-葡聚糖產(chǎn)品。

1.2.3β-葡聚糖含量測(cè)定及得率計(jì)算 根據(jù)剛果紅法[22]測(cè)定β-葡聚糖含量,配制1 mg/mL的β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液冷藏待用,將剛果紅溶解于pH8.0的磷酸緩沖液中,配制0.1 mol/L的剛果紅溶液。將β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋為20、40、60、80、100μg/mL,分別取2 mL不同濃度β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液加4 mL剛果紅溶液,25 ℃水浴30 min,以2 mL蒸餾水加4 mL剛果紅溶液為空白對(duì)照,于545 nm處測(cè)定吸光值。吸光值與β-葡聚糖標(biāo)品含量的線性方程為y=2.83x-0.002(R2=0.9966)。 式中縱坐標(biāo)y代表吸光度值,橫坐標(biāo)x代表β-葡聚糖含量(μg/mL)。將冷凍干燥后的β-葡聚糖粉末溶于蒸餾水中,配成1 mg/mL的β-葡聚糖溶液,測(cè)定吸光值,計(jì)算β-葡聚糖含量,再按以下公式計(jì)算β-葡聚糖得率和純度。

青稞β-葡聚糖得率(%)=β-葡聚糖粉末的質(zhì)量/青稞麩皮粉的質(zhì)量×100

式(1)

青稞β-葡聚糖純度(%)=β-葡聚糖粉末中β-葡聚糖的質(zhì)量/β-葡聚糖粉末質(zhì)量×100

式(2)

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣,用考馬斯亮藍(lán)法[23]繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液冷藏待用;稱取10 mg考馬斯亮藍(lán)G250,加5 mL95%乙醇溶解,再加入10 mL 85%磷酸溶液,最后用蒸餾水定容至100 mL,置于棕色瓶中備用。將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為20、40、60、80、100 μg/mL,分別取1 mL不同濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液混勻,常溫靜置10 min,以1 mL蒸餾水加5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液為空白對(duì)照,于595 nm處測(cè)定吸光值。吸光值與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性方程為y=8.7171x+0.0225(R2=0.9976),將冷凍干燥后的β-葡聚糖粉末溶于蒸餾水中,配成1 mg/mL的β-葡聚糖溶液,測(cè)定吸光值,通過(guò)測(cè)定樣品吸光度值可計(jì)算得蛋白質(zhì)含量。

式(3)

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 固定基本條件為接種量0.05%(酵母/麩皮,g/g),料液比1∶5,發(fā)酵時(shí)間36 h,發(fā)酵溫度32 ℃。研究不同菌種(高活性干酵母、釀酒干酵母、啤酒干酵母、葡萄酒干酵母)、接種量(0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%)、料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)、發(fā)酵溫度(28、30、32、34、36 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(6、12、18、24、36、42、48 h)等因素對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖得率的影響。

1.2.6 正交優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇料液比(A)、接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),優(yōu)化發(fā)酵法提取青稞麩皮β-葡聚糖的工藝,因素水平的選擇見表1。

表1 發(fā)酵法提取β-葡聚糖正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test for extracting β-glucan by fermentation method

1.2.7β-葡聚糖分子量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[24-26]通過(guò)HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用分析發(fā)酵法優(yōu)化工藝制備的樣品和1.2.2實(shí)驗(yàn)所得到的兩個(gè)樣品的分子量分布。分別稱取兩種樣品5 mg于1 mL流動(dòng)相,過(guò)0.22 μL的水相微孔膜,上樣分析。實(shí)驗(yàn)通過(guò)Waters2695型高效液相色譜儀連接MALLS、RI System。TSK-GEL系列凝膠色譜柱G6000PWXL、G4000PWXL串聯(lián)使用,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量100 μL,流動(dòng)相為0.15 mol/L 的硝酸鈉和0.05 mol/L 磷酸二氫鈉(pH=7,0.02%疊氮鈉),流速0.5 mL/min進(jìn)行等度洗脫分析。8角度激光光散射儀的光源波長(zhǎng)選用623.8 nm,溶液中多糖折光指數(shù)增量(dn/dc)為0.146 mL/g進(jìn)行計(jì)算。使用Astra(6.1.1版)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析軟件收集和分析光散射數(shù)據(jù),計(jì)算分子量。

1.2.8 單糖組成的測(cè)定 采用高效陰離子交換色譜分析法對(duì)所得的樣品進(jìn)行單糖組成測(cè)定[27-29]。稱取2 mg樣品溶于3 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸,加入反應(yīng)瓶中。然后放置在110 ℃油浴中水解3 h。冷卻至室溫,加入3 mL甲醇,用氮?dú)庠?40 ℃下吹干,重復(fù)4～5次以完全除去三氟乙酸。將反應(yīng)瓶中的樣品用超純水定容至25 mL待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品:L-海藻糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖醛酸、D-葡糖醛酸混標(biāo)。實(shí)驗(yàn)采用帶脈沖安培檢測(cè)器的ICS2500 離子色譜儀,連接陰離子交換分析色譜柱Carbo PacTMPA20(3 mm×150 mm),2.5 mmol/L的NaOH溶液和超純水為流動(dòng)相,流速為0.45 mL/min,上樣量25 μL,柱溫為30 ℃,進(jìn)行等度洗脫分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中的試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次,運(yùn)用Microsoft Excel 2003、Origin 8.0和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、圖表繪制和顯著性分析(以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌發(fā)酵對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖提取效果的影響

運(yùn)用四種活性干酵母發(fā)酵獲得的β-葡聚糖得率結(jié)果如圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵法獲得β-葡聚糖的得率均較水提法高,這是由于酵母中含有豐富的酶系統(tǒng),使青稞麩皮中的β-葡聚糖更好地溶解出來(lái),四種酵母中高活性干酵母發(fā)酵得率最高,β-葡聚糖得率為4.78%±0.03%,較水提法高47.53%,因此選取高活性干酵母為發(fā)酵菌種。

圖1 不同酵母菌對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.1 Effects of different yeasts on extraction yield of β-glucan注:不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2～圖5同。

2.2 發(fā)酵法提取青稞β-葡聚糖單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖提取效果的影響 隨著料液比的提高,β-葡聚糖的得率先增加后穩(wěn)定(圖2),料液比太小時(shí)β-葡聚糖無(wú)法充分溶解,料液比增大后得率也隨著增大;當(dāng)料液比為1∶5時(shí),β-葡聚糖得率為4.98%±0.03%,與料液比為1∶6、1∶7結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于料液比1∶3、1∶4(P<0.05),根據(jù)液固相萃取的基本理論,增大料液比有利于溶質(zhì)的溶出,但是過(guò)大的料液比不僅增加了水的消耗,而且增高了后續(xù)的濃縮成本[30],因此選取料液比1∶5。

圖2 料液比對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on extraction yield of β-glucan

2.2.2 接種量對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖提取效果的影響 接種量為0.01%～0.05%時(shí),β-葡聚糖得率快速增加(圖3),接種量為0.05%時(shí),β-葡聚糖得率為4.48%±0.04%,與接種量為0.07%、0.09%無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于接種量為0.01%、0.03%(P<0.05),這是由于0.05%接種量已經(jīng)使發(fā)酵液達(dá)到飽和,雖然增加接種量β-葡聚糖還在不斷析出,但是對(duì)實(shí)際生產(chǎn)意義不大,因此選擇接種量為0.05%。

圖3 接種量對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on extraction yield of β-glucan

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖提取效果的影響 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),β-葡聚糖的得率先增加后趨于平緩(圖4),發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí),β-葡聚糖得率為4.88%±0.03%,與42、48 h試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于發(fā)酵時(shí)間為6、12、18、24 h(P<0.05)。這是由于在前18 h內(nèi)酵母大量繁殖,利用自身酶系統(tǒng)通過(guò)發(fā)酵分解纖維素,到36 h時(shí)反應(yīng)幾乎完全,因此選取36 h為最適發(fā)酵時(shí)間。并且在36 h時(shí)通過(guò)淀粉碘試實(shí)驗(yàn)[28],發(fā)酵液未使得碘液變色,說(shuō)明淀粉已被消耗完,規(guī)避了后續(xù)除淀粉的操作步驟。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.4 Effects of fermentation time on extraction yield of β-glucan

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)青稞麩皮β-葡聚糖提取效果的影響 隨著發(fā)酵溫度在28～36 ℃升高,β-葡聚糖的得率先升高后略有下降(圖5)。在32 ℃條件下獲得的β-葡聚糖得率為4.76%±0.04%,與在34和36 ℃之間無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于28、30 ℃(P<0.05),這可能的原因是在32 ℃時(shí)酵母內(nèi)環(huán)境較穩(wěn)定,新陳代謝所需的酶活性達(dá)到較高水平[31],因此選取32 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on extraction yield of β-glucan

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果見表2。由表2極差分析可知,影響因素強(qiáng)弱順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>料液比>接種量。青稞β-葡聚糖提取的最佳工藝條件是A3B2C1,即提取效果最佳條件為料液比1∶6,接種量0.05%,發(fā)酵時(shí)間34 h。方差分析結(jié)果見表3,由表3也可以看出,影響青稞β-葡聚糖得率的三個(gè)因素排序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、料液比和接種量,這與表2分析結(jié)論是一致的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最佳條件,結(jié)果顯示發(fā)酵法提取的青稞β-葡聚糖的得率平均為5.21%±0.02%,優(yōu)化條件可行。

表2 發(fā)酵法提取β-葡聚糖正交試驗(yàn)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test table and experimental results of extraction of β-glucan by fermentation method

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.4 發(fā)酵法提取β-葡聚糖的理化分析

2.4.1β-葡聚糖的保留率與純度 比較了發(fā)酵法與水提法獲得的青稞β-葡聚糖的保留率和蛋白質(zhì)清除率,其結(jié)果見表4。發(fā)酵法得到的β-葡聚糖中含的蛋白質(zhì)含量明顯低于水提法得到的β-葡聚糖。兩種方法得到的β-葡聚糖經(jīng)過(guò)除蛋白處理后的β-葡聚糖保留率均在70%以上。

表4 活性炭吸附后β-葡聚糖保留率、純度及蛋白質(zhì)清除率Table 4 β-glucan retention,purity and protein clearance rate after activated carbon adsorption

2.4.2β-葡聚糖分子量的測(cè)定 用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用法測(cè)定2種方法提取的β-葡聚糖分子量分布圖(圖6),運(yùn)用激光檢測(cè)器和 Astra 軟件分析后所得結(jié)果為:水提的青稞β-葡聚糖平均分子量為7.759×105,與董磊[21]水提法提取青稞麩皮β-葡聚糖中結(jié)果相似;發(fā)酵法提取的青稞β-葡聚糖平均分子量為1.366×105,較水提法平均分子量小。

圖6 兩種提取方法得到的β-葡聚糖HPSCE圖譜Fig.6 HPSCE profile of β-glucan obtained by two extraction methods

2.4.3β-葡聚糖的單糖組成分析 標(biāo)準(zhǔn)單糖組成(圖7)與水提法β-葡聚糖單糖組成(圖8)、發(fā)酵法β-葡聚糖單糖組成(圖9)相比較發(fā)現(xiàn):水提法提取的青稞β-葡聚糖中具有較多的雜糖,如D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖,與文獻(xiàn)[21]中結(jié)果相符,其產(chǎn)品需要額外加入除雜工藝;而發(fā)酵法提取的青稞β-葡聚糖中主要為D-葡萄糖以及少量D-木糖。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)單糖組成Fig.7 Standard monosaccharide composition注:1:L-海藻糖;2:L-鼠李糖;3:D-阿拉伯糖;4:D-氨基葡萄糖;5:D-半乳糖;6:D-葡萄糖;7:D-木糖;8:D-甘露糖;9:D-果糖;10:D-半乳糖醛酸;11:D-葡糖醛酸。

圖8 水提法β-葡聚糖單糖組成Fig.8 Composition of the β-glucan monosaccharide by water extraction

圖9 發(fā)酵法β-葡聚糖單糖組成Fig.9 Composition of the β-glucan monosaccharide by fermentation extraction

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)得到的發(fā)酵法提取β-葡聚糖最佳工藝條件為:高活性干酵母為菌種、接種量0.05%、料液比1∶6,發(fā)酵溫度32 ℃,發(fā)酵時(shí)間34 h,在該條件下β-葡聚糖平均得率為5.21%,與傳統(tǒng)水提法提取的青稞β-葡聚糖相比,得率提高了60.8%。水提法提取的青稞β-葡聚糖單糖組成為D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖以及D-甘露糖。而通過(guò)發(fā)酵法得到的青稞β-葡聚糖單糖組成主要為D-葡萄糖,且與水提法相比含有更少量的蛋白質(zhì),通過(guò)活性炭吸附可以清除掉97.81%,純度可達(dá)到91.21%。通過(guò)理化分析比較發(fā)現(xiàn)水提β-葡聚糖平均分子量為7.759×105,發(fā)酵法提取的β-葡聚糖平均分子量為1.366×105。