無窖泥發(fā)酵生產(chǎn)濃香型白酒

任雪，魏曉慶，韓雨辰，李洋，肖冬光

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

中國傳統(tǒng)白酒由于其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和產(chǎn)品風(fēng)格，在世界六大蒸餾酒中占有重要的地位，而作為中國傳統(tǒng)白酒的典型風(fēng)味代表之一的濃香型白酒，其生產(chǎn)量最大，國家名酒品牌最多，深受消費(fèi)者喜愛[1-4]。傳統(tǒng)濃香型白酒釀造工藝的獨(dú)特之處在于“泥窖固態(tài)發(fā)酵，續(xù)糟配料，混蒸混燒”，泥窖除了作為蓄積酒醅進(jìn)行發(fā)酵的容器外，還與各種呈香呈味物質(zhì)的生成密切相關(guān)。以己酸菌群為主的泥窖微生物和以酵母菌群、乳酸菌群為主的酒醅微生物相比，各自的生長和代謝條件不同，但都在發(fā)酵過程中進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)代謝與交換，最終形成了濃香型白酒獨(dú)特的成分構(gòu)成和風(fēng)味特征[5-8]。濃香型白酒的特征香味成分是己酸乙酯，它與適量的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和其他香味成分組成復(fù)合香氣，其四大酯比例協(xié)調(diào)，具有窖香濃郁，綿甜凈爽的特點(diǎn)[9-13]。

由于傳統(tǒng)濃香型白酒泥窖發(fā)酵的特殊方式，使得糟醅出入窖池很大程度上依賴于人工操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大，機(jī)械化程度低[14]。而且由于窖泥的存在，常給原酒帶來土腥味和泥臭味[15-16]，需要進(jìn)行一系列復(fù)雜的處理，從而增加了凈化成本[17-18]。針對(duì)以上問題，研究人員提出了一系列解決辦法，河套酒業(yè)采用“行車抓斗”出窖，形成有序的物料輸送鏈條，降低勞動(dòng)強(qiáng)度[19]。但這種方式容易把窖泥帶到蒸餾酒醅中，影響原酒質(zhì)量；為了不使原酒帶有泥臭味，對(duì)接近窖壁的酒醅只能采用傳統(tǒng)方式人工出窖，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不便于管理。

為了打破泥窖對(duì)濃香型白酒機(jī)械化的限制，本研究先對(duì)己酸菌群?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)，待前發(fā)酵酒醅中的乙醇含量到達(dá)高峰時(shí)再混入己酸發(fā)酵液進(jìn)行后發(fā)酵，最終確定己酸發(fā)酵液添加量、添加時(shí)間及總發(fā)酵周期，從而繞開泥窖實(shí)現(xiàn)無窖泥發(fā)酵生產(chǎn)濃香型白酒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料和試劑

原料：高粱、濃香型大曲、酒糟、優(yōu)質(zhì)窖泥，均取自某濃香型酒廠。

試劑：(NH4)2SO4、K2HPO4、乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙酸鈉、CaCO3、MgSO4，天津市化學(xué)試劑一廠；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)公司。以上均為分析純。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

己酸菌種子培養(yǎng)基(g/L)：乙酸鈉5，(NH4)2SO40.5，K2HPO40.4，MgSO40.2，酵母浸粉1，自然pH，121 ℃滅菌20 min，在干熱滅菌后接種前加入10 g/L CaCO3，過濾除菌后加入體積分?jǐn)?shù)為20%無水乙醇[20]。

己酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乙酸鈉7，(NH4)2SO40.5，K2HPO40.4，MgSO40.2，酵母浸粉5，自然pH，121 ℃滅菌20 min，于干熱滅菌后接種前加入10 g/L CaCO3，過濾除菌后加入體積分?jǐn)?shù)為15%無水乙醇。

1.2 分析方法

乙醇體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定：采用酒精計(jì)法[21]；酸度的測(cè)定：采用酸堿滴定指示劑法[22]；殘淀粉的測(cè)定：采用斐林試劑法[23]。

主要風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定[24]：取100 g酒醅，加入200 mL蒸餾水，蒸餾并接取酒液100 mL，充分混勻，取樣進(jìn)行氣相色譜法測(cè)定。檢測(cè)條件：Agilent HP-INNOWAX色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；載氣為高純氮?dú)?>99.999%)；柱流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度150 ℃；程序升溫，起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 己酸發(fā)酵液的制備

選取優(yōu)質(zhì)窖泥，85 ℃水浴處理10 min，置于30～35 ℃厭氧培養(yǎng)7～12 d，挑選產(chǎn)氣較多的菌液，補(bǔ)充新的培養(yǎng)基繼續(xù)熱處理，連續(xù)富集培養(yǎng)3次，得到己酸菌富集菌液[25]。

取己酸菌富集菌液按7%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于35 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，從發(fā)酵第6天開始，每天取樣進(jìn)行己酸和丁酸的測(cè)定，確定最終發(fā)酵時(shí)間，使己酸含量達(dá)到10 g/L左右，且己酸、丁酸比例適宜。

1.3.2 前發(fā)酵工藝

原料粉碎：以優(yōu)質(zhì)高粱為原料，粉碎度要求通過20目孔篩占70%～75%以上。

潤料：高粱粉用相當(dāng)于原料質(zhì)量60%的60～70 ℃水拌勻，堆積潤料18～20 h。

蒸料：潤好的物料拌入相當(dāng)于高粱粉質(zhì)量20%的稻殼(已清蒸過)，拌勻后蒸料，圓汽后蒸1 h。

配料發(fā)酵：蒸熟的物料冷卻至30 ℃左右，拌入傳統(tǒng)發(fā)酵的酒糟，配糟比(高粱∶新鮮酒糟，質(zhì)量比)為1∶3～4，以配料后物料可發(fā)酵淀粉含量16%～18%、酸度1.6～2.0 mmol/10 g為宜，拌入濃香型大曲粉的質(zhì)量相當(dāng)于高粱質(zhì)量的10%～12%，裝瓶，30 ℃下靜置發(fā)酵，發(fā)酵開始后每天進(jìn)行稱重，發(fā)酵至第4天開始，每天取樣進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘淀粉的測(cè)定，依據(jù)指標(biāo)確定前發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 后發(fā)酵

1.3.3.1 己酸發(fā)酵液添加時(shí)間的確定

按照1.3.2的方法進(jìn)行前發(fā)酵，分別在發(fā)酵至第5、6、7、8天添加0.40 g/kg己酸發(fā)酵液，繼續(xù)后發(fā)酵至第14天，取樣分析，確定己酸發(fā)酵液的添加時(shí)間。

1.3.3.2 己酸發(fā)酵液添加量的確定

按照1.3.2的方法進(jìn)行前發(fā)酵，在發(fā)酵至第6天時(shí)，分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/kg的己酸發(fā)酵液，繼續(xù)后發(fā)酵至第14天，取樣分析，確定己酸發(fā)酵液的添加量。

1.3.3.3 總發(fā)酵周期的確定

按照1.3.2的方法進(jìn)行前發(fā)酵，在發(fā)酵至第6天，添加0.40 g/kg的己酸發(fā)酵液，進(jìn)行后發(fā)酵，分別在發(fā)酵至第14、21、28、35、42天，取樣分析，確定最終發(fā)酵周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間的確定

按照1.3.1的方法，將己酸菌富集菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第6天時(shí)開始產(chǎn)生輕微氣泡，之后每天取樣，測(cè)定己酸、丁酸含量，產(chǎn)酸情況如圖1所示。培養(yǎng)6～9 d，己酸含量逐漸增加，且增長幅度較大，而丁酸含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，繼續(xù)延長培養(yǎng)時(shí)間，己酸、丁酸的含量均趨于平穩(wěn)，當(dāng)培養(yǎng)至第9天時(shí)，己酸含量為9.651 g/L，丁酸含量為2.031 g/L。

圖1 己酸、丁酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化情況

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，丁酸是己酸合成過程中的底物之一[26]，所以隨著己酸含量的增加，丁酸含量有降低趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵至第9天時(shí)，己酸、丁酸含量均趨于平穩(wěn)，且己酸、丁酸的比例較適宜，因此確定發(fā)酵時(shí)間為9 d。

2.2 前發(fā)酵時(shí)間的確定

按照1.3.2的方法進(jìn)行前發(fā)酵。前發(fā)酵過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、殘淀粉以及失重隨著發(fā)酵時(shí)間的變化情況如圖2所示。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，失重和乙醇體積分?jǐn)?shù)先增加后趨于穩(wěn)定，殘淀粉先降低后趨于穩(wěn)定。酒醅菌群主要是以酵母菌和乳酸菌等兼性厭氧菌或好氧菌為主要菌群，而窖泥菌群是以己酸菌等厭氧菌為主要菌群，它們的生長環(huán)境和代謝機(jī)制不同，酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精對(duì)己酸菌群有抑制作用，而窖泥菌群發(fā)酵產(chǎn)生的己酸等代謝物對(duì)釀酒酵母也有抑制作用。如果己酸發(fā)酵液添加時(shí)間過早，己酸、丁酸等代謝物會(huì)對(duì)酵母的生長和代謝產(chǎn)生抑制作用，使發(fā)酵不徹底，殘淀粉過高而乙醇含量過低；如果己酸發(fā)酵液添加時(shí)間過晚，己酸、丁酸等與乙醇的酯化時(shí)間短，會(huì)導(dǎo)致合成的風(fēng)味物質(zhì)不足。當(dāng)發(fā)酵6～8 d，乙醇含量達(dá)到高峰，所以應(yīng)該選擇在此時(shí)間段內(nèi)添加己酸發(fā)酵液。

圖2 前發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)變化情況

2.3 后發(fā)酵

前發(fā)酵結(jié)束后，添加己酸發(fā)酵液，進(jìn)行后發(fā)酵，根據(jù)各項(xiàng)理化指標(biāo)，確定己酸發(fā)酵液的添加時(shí)間、添加量和總發(fā)酵周期。

2.3.1 己酸發(fā)酵液添加時(shí)間的確定

己酸發(fā)酵液添加時(shí)間對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、殘淀粉的影響如圖3所示。

圖3 己酸發(fā)酵液添加時(shí)間對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、殘淀粉的影響

隨著己酸發(fā)酵液添加時(shí)間的延后，乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸上升，殘淀粉逐漸降低。說明己酸發(fā)酵液添加時(shí)間過早會(huì)影響酒醅中酵母菌生長、代謝，進(jìn)而影響乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘淀粉的含量。

不同時(shí)間添加己酸發(fā)酵液對(duì)主要風(fēng)味物質(zhì)的影響如表1所示。隨著己酸發(fā)酵液添加時(shí)間的延后，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，而己酸乙酯和丁酸乙酯的含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，總高級(jí)醇的合成量差異不顯著。因?yàn)殡S己酸發(fā)酵液添加時(shí)間的延后，己酸、丁酸與乙醇的作用時(shí)間縮短，導(dǎo)致己酸乙酯和丁酸乙酯的含量降低；而過早添加己酸發(fā)酵液會(huì)抑制大曲中酵母菌群和乳酸菌群的生長和代謝，進(jìn)而影響乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成。綜合己酸發(fā)酵液添加時(shí)間對(duì)主要風(fēng)味物質(zhì)、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及發(fā)酵酒醅中物質(zhì)利用情況，選擇發(fā)酵6 d時(shí)添加己酸發(fā)酵液。

表1 己酸發(fā)酵液添加時(shí)間對(duì)主要風(fēng)味物質(zhì)的影響 單位:mg/L

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 己酸發(fā)酵液添加量的確定

如表2所示，隨著己酸發(fā)酵液添加量的增多，乙酸乙酯含量逐漸增加，乳酸乙酯含量呈降低趨勢(shì)，己酸乙酯含量先增加后變化不顯著，而丁酸乙酯含量變化不顯著。

從高級(jí)醇來看，正丙醇和異戊醇含量隨著己酸發(fā)酵液添加量增多而減少，異丁醇和苯乙醇含量變化不顯著。由于添加過多的己酸發(fā)酵液沒有顯著提高己酸乙酯含量，并且會(huì)導(dǎo)致酒體中剩余過多的己酸，影響酒體平衡，綜合來看，選擇己酸發(fā)酵液的添加量為0.40 g/kg。

表2 己酸發(fā)酵液添加量對(duì)主要風(fēng)味物質(zhì)的影響 單位:mg/L

2.3.3 發(fā)酵周期的確定

從表2可以看出，通過提高己酸發(fā)酵液的添加量不能顯著增加己酸乙酯和丁酸乙酯的含量，因此要延長發(fā)酵時(shí)間使己酸、丁酸和乙醇在大曲酯化酶的作用下繼續(xù)合成己酸乙酯和丁酸乙酯，確定最終發(fā)酵周期使?jié)庀阈桶拙扑拇篚ケ壤齾f(xié)調(diào)，己酸乙酯香氣突出。

如圖4所示，隨發(fā)酵周期的延長，乙醇體積分?jǐn)?shù)有降低的趨勢(shì)，酸度有增加趨勢(shì)，殘淀粉基本穩(wěn)定。因?yàn)楹铣甚ヮ愐约皳]發(fā)等因素影響，酒精會(huì)有所消耗，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)略微降低，而隨著發(fā)酵周期的延長，一些有機(jī)酸會(huì)增加，所以酸度有增加趨勢(shì)。

圖4 發(fā)酵周期對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、酸度以及殘淀粉的影響

如表3所示，隨發(fā)酵周期的延長，乙酸乙酯含量呈現(xiàn)略微降低趨勢(shì)，乳酸乙酯含量變化不顯著，己酸乙酯和丁酸乙酯的含量均顯著增加；從高級(jí)醇方面看，總體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。由于發(fā)酵時(shí)間的延長，乙酸乙酯逐漸被分解而有所降低，而己酸、丁酸與乙醇逐漸合成己酸乙酯和丁酸乙酯，所以均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。綜合看來，發(fā)酵周期為42 d時(shí)，四大酯比例較協(xié)調(diào)，且酒精含量維持在一定水平，符合濃香型白酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，確定最終發(fā)酵周期為42 d。

表3 發(fā)酵周期對(duì)主要風(fēng)味物質(zhì)的影響 單位:mg/L

3 結(jié)果與討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，己酸發(fā)酵液添加時(shí)間、添加量以及總發(fā)酵周期，對(duì)濃香型白酒四大酯的平衡起到很大作用。若己酸發(fā)酵液添加時(shí)間過早，對(duì)乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成有抑制作用，而添加過晚會(huì)影響己酸乙酯和丁酸乙酯的合成。當(dāng)總發(fā)酵周期為14 d(表2)，己酸發(fā)酵液的添加量由0.20 g/kg增加至0.40 g/kg時(shí)，己酸乙酯的含量增加了35.46%；再加大己酸發(fā)酵液的添加量，己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加不顯著，而乙酸乙酯的含量明顯增加，乳酸乙酯含量有所下降，說明在發(fā)酵周期較短的情況下并不能通過加大己酸發(fā)酵液的量來提高己酸乙酯的含量。通過延長發(fā)酵周期可顯著提高己酸乙酯的含量(表3)，丁酸乙酯的含量也有所增加，乙酸乙酯的含量稍有下降，而乳酸乙酯的含量變化不明顯，四大酯比例趨于平衡。由此可見，可以通過對(duì)己酸發(fā)酵液添加時(shí)間、添加量以及總發(fā)酵周期的調(diào)控來有效控制四大酯的含量并協(xié)調(diào)其比例，從而實(shí)現(xiàn)無窖泥發(fā)酵生產(chǎn)濃香型白酒的目的。