PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定地參多糖的單糖組成

黃小蘭，何旭峰，楊勤，張椿翊，周濃

1(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 萬(wàn)州，4041200 2(重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 萬(wàn)州，404120)3(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 中醫(yī)學(xué)院，重慶 萬(wàn)州，404120)

地參俗稱蟲(chóng)草參、銀條菜、瓜兒苗，為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel)的干燥根莖，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[1-2]。地參含有豐富的多糖類、萜類與甾體、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油等化合物[3-6]，其中地參多糖因具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、免疫調(diào)節(jié)[6,9]、降血糖[10]等生物活性而備受關(guān)注。

地參在我國(guó)分布較為廣泛，主要產(chǎn)區(qū)包括云南、重慶、山東、四川、陜西、河北及東北等地[11]。目前有關(guān)地參多糖的研究多集中于總多糖的提取工藝優(yōu)化[12-14]及其生物活性[7-10]方面，但是對(duì)地參多糖整體的單糖組成分析及深入研究鮮見(jiàn)報(bào)道。而植物多糖的生物活性與其單糖組成、比例等密切相關(guān)[15-18]。本研究采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)柱前衍生化法[19-22]，即單醛糖在堿性條件下，與PMP相結(jié)合生成具有紫外吸收的化合物，建立高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-photo diode array, HPLC-PDA)檢測(cè)地參單糖組成的方法，并通過(guò)主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地的地參樣品中單糖進(jìn)行差異分析，旨在為地參多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參采自或委托采集于云南、重慶、廣西、江蘇、山東等地參栽培基地(表4)，鑒定為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel)的干燥根莖。

D-甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、D-半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)分別為：DST170307-047、DST190315-033、DST1180427-567、DST190312-063、DST190304-011、DST180427-565，純度均≥98%以上)，成都德思特生物技術(shù)有限公司；半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111646-200301，純度≥98%以上)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：Must-3122601，純度≥98%以上)，成都曼思特生物科技有限公司。

石油醚(60～90 ℃)、無(wú)水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸(TFA)、HCl、NaOH、PMP、NaH2PO4、Na2HPO4均為分析純，成都科龍化學(xué)品有限公司；色譜純乙腈，迪馬科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器PDA)，日本島津公司；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)(電阻率≥18.2 MΩ·cm)，美國(guó)Millipore公司；Sigma 4-16S型與Sigma 3-30KS型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；IKA MS3型渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；Sartorius SQP電子分析天平(精密度為0.01 mg)，德國(guó)Sartorius公司；KH-2000DB型超聲波清洗機(jī)(功率2 000 W，頻率40 kHz)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BPG-9240A型精密鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取D-甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D-無(wú)水葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖8種單糖對(duì)照品適量，用水溶解制得質(zhì)量濃度分別為0.672 2、1.330 8、0.834 0、0.568 0、2.071 7、2.039 4、0.514 5、0.576 2 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，并逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

1.3.2.1 地參多糖的提取[12-14]

地參樣品經(jīng)50 ℃干燥，粉碎過(guò)35目篩，備用。

脫脂：取一定量的地參粉末，加入適量石油醚(60～90 ℃)，在60 ℃水浴中回流1.5 h脫脂，揮干溶劑。

提?。簻?zhǔn)確稱取1 g(精確至0.000 1 g)脫脂后的樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 80 ℃蒸餾水超聲提取(功率300 W，頻率40 kHz)，30 min取出放至室溫，加入Sevage試劑[V(正丁醇)∶V(三氯甲烷)=1∶5]10 mL，渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于錐形瓶中，加水10 mL，重復(fù)操作2次，合并上清液，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻。于4 ℃條件下靜置24 h，離心，棄去上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次，除掉單糖及低聚糖成分，水浴揮干無(wú)水乙醇，用水將沉淀溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，制得地參多糖溶液，備用。

1.3.2.2 地參多糖的水解

取上述地參多糖溶液1.0 mL于頂空瓶中，加入2.0 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，迅速密封。110 ℃條件下水解5 h，取出，冷卻至室溫，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻備用。

1.3.2.3 地參單糖的衍生

分別取1.3.1的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及1.3.2.2中的地參多糖水解溶液200 μL于10 mL離心管中，加入0.5 mol/L NaOH溶液200 μL，混勻，再加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液500 μL，混勻，在70 ℃水浴條件下衍生1 h，取出，冷卻至室溫，加入0.5 mol/L HCl溶液200 μL，混勻，加入三氯甲烷1.0 mL，渦旋1 min，8 000 r/min冷凍離心5 min，棄去下層液，重復(fù)3次，除掉多余的PMP溶液，取上清液定容至2 mL，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.3.3 色譜條件[19-20,22]

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.75)，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 單糖衍生物的梯度洗脫程序

1.3.4 地參多糖水解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 三氟乙酸濃度的考察

分別取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5個(gè)頂空瓶中，平行3份，分別加入2.0 mL濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的三氟乙酸溶液，110 ℃水解5 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及單糖總含量考察三氟乙酸溶液濃度的影響。

1.3.4.2 水解溫度的考察

分別取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5個(gè)頂空瓶中，平行3份，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，分別在80、90、100、110、120 ℃水解5 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及單糖總含量考察水解溫度的影響。

1.3.4.3 水解時(shí)間的考察

分別取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5個(gè)頂空瓶中，平行3份，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，于110 ℃下分別水解3、4、5、6、7 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及單糖總含量考察水解時(shí)間的影響。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相體系的選擇

參考文獻(xiàn)[19-20,22]，流動(dòng)相體系主要為磷酸鹽緩沖液-乙腈反相等度洗脫。本試驗(yàn)采用V(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液)∶V(乙腈)=83∶17等梯度洗脫時(shí)，8種單糖衍生物均能夠很好的分離，但是分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)65 min。提高乙腈比例可以有效縮短分析時(shí)間，但是會(huì)造成鼠李糖和葡萄糖醛酸分離度不夠，故本試驗(yàn)采用梯度洗脫，既能達(dá)到良好的分離度，同時(shí)縮短分析時(shí)間，目標(biāo)物在45 min出峰完成。在優(yōu)化后的色譜條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1-甘露糖；2-鼠李糖；3-葡萄糖醛酸；4-半乳糖醛酸；5-葡萄糖；6-半乳糖；7-阿拉伯糖；8-巖藻糖

2.2 地參多糖水解條件的確定

2.2.1 三氟乙酸濃度對(duì)地參多糖水解的影響

由圖2可知，隨著三氟乙酸濃度的增大，地參多糖水解能力增強(qiáng)，相應(yīng)的單糖含量增多，當(dāng)濃度大于2.0 mol/L時(shí)，單糖含量略有下降趨勢(shì)，這可能與多糖在高濃度酸的條件下發(fā)生水解逆反應(yīng)有關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)選擇三氟乙酸的濃度為2.0 mol/L。

圖2 三氟乙酸濃度對(duì)地參多糖水解的影響

2.2.2 水解溫度對(duì)地參多糖水解的影響

由圖3可知，隨著水解溫度的升高，地參多糖糖苷鍵水解成單糖的速率加快，溫度在110 ℃后單糖含量基本穩(wěn)定，表明地參多糖已經(jīng)水解完全，故本方法確定水解溫度為110 ℃。

圖3 水解溫度對(duì)地參多糖水解的影響

2.2.3 水解時(shí)間對(duì)地參多糖水解的影響

由圖4可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，地參多糖水解效率提高，在5 h內(nèi)達(dá)到峰值隨后趨于穩(wěn)定，表明地參多糖已經(jīng)水解完全，為了縮短分析時(shí)間、節(jié)約能源，本實(shí)驗(yàn)確定水解時(shí)間為5 h。

圖4 水解時(shí)間對(duì)地參多糖水解的影響

2.2.4 最佳條件的確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，地參多糖完全水解最佳條件為：三氟乙酸濃度2.0 mol/L，水解溫度110 ℃，水解時(shí)間5 h。

2.3 線性關(guān)系、檢出限的考察

取1.3.1的8種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.2.3的步驟進(jìn)行衍生，以1.3.3的色譜條件依次進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，以各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(y)與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比計(jì)算檢出限(RS/N=3)，結(jié)果如表2所示。8種單糖的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，表明線性關(guān)系良好；8種單糖的檢出限范圍為0.16～0.85 μg/mL，表明儀器靈敏度高。

2.4 儀器精密度考察

取同一衍生后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.3.3的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各單糖色譜峰峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值。結(jié)果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖峰面積的RSD值分別為0.50%、0.38%、0.60%、0.56%、1.09%、1.20%、0.37%、0.38%，均小于1.50%，表明儀器精密度良好，可進(jìn)行樣品分析。

表2 八種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 衍生試樣穩(wěn)定性考察

取衍生后的樣品溶液(S1)，分別在0、2、4、8、12、16、24 h時(shí)間點(diǎn)按照1.3.3進(jìn)樣，計(jì)算各單糖色譜峰的RSD值。結(jié)果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖峰面積的RSD值分別為2.81%、1.55%、2.64%、1.90%、0.26%、0.71%、1.92%、2.75%，表明單糖經(jīng)衍生后生成的物質(zhì)在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，對(duì)進(jìn)樣時(shí)間無(wú)特殊要求。

2.6 方法重復(fù)性考察

精密稱取樣品(S1)1.0 g，平行6份，按照1.3.2制備樣品溶液，并按1.3.3的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各單糖色譜峰峰面積，并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖峰面積的RSD值分別為2.86%、2.15%、1.17%、2.10%、0.25%、0.68%、1.83%、3.07%，表明該方法的重復(fù)性良好，可用于其他地參樣品中單糖的組成和含量測(cè)定。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)考察

移取制備好的多糖樣品溶液(S1)0.50 mL于頂空瓶中，分別加入高、中、低3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.3.2.2及1.3.2.3進(jìn)行水解、衍生化操作，各加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及RSD值，見(jiàn)表3。

表3 八種單糖的回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

結(jié)果表明8種單糖高、中、低3個(gè)水平的平均回收率為82.58%～108.71%，RSD值為0.03%～1.44%，表明該方法的準(zhǔn)確性好，精密度高。

2.8 地參多糖的單糖組成及含量

取6個(gè)不同產(chǎn)地地參樣品按照1.3.2進(jìn)行制備樣品溶液，注入高效液相色譜儀測(cè)定其多糖中單糖組成及含量，并計(jì)算各單糖組分間物質(zhì)的量比，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。地參樣品中均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖8種單糖，但含量上存在一定的差異，甘露糖的含量為0.099～0.230 mg/g，鼠李糖的含量為0.048～0.114 mg/g，葡萄糖醛酸含量為0.052～0.093 mg/g，半乳糖醛酸含量為0.150～1.429 mg/g，葡萄糖含量為26.063～47.666 mg/g，半乳糖含量為98.693～145.308 mg/g，阿拉伯糖含量為0.454～0.566 mg/g，巖藻糖含量為0.099～0.176 mg/g。同時(shí)，從表4可以看出地參中半乳糖、葡萄糖的含量較高，為地參單糖的主要成分。由表5可知，8種單糖組分的平均物質(zhì)的量比為：甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖=1.00∶0.60∶0.54∶5.15∶266.53∶890.11∶4.12∶1.05。

表4 地參多糖的單糖組成及含量 單位：mg/g

表5 地參多糖中單糖的物質(zhì)的量比(n=3)

2.9 主成分分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)6個(gè)樣品的單糖含量進(jìn)行主成分分析，并對(duì)其進(jìn)行主成分得分計(jì)算以及排序，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6 樣品主成份距陣

表7 樣品主成分得分、綜合得分及其排序

注：PC1,PC2為主成分得分；C為綜合得分

從多糖的8個(gè)單糖組分中提取出了2個(gè)主成分(特征值>1)，主成分1的特征值為5.334，特征貢獻(xiàn)率為66.67%；主成分2的特征值為1.180，特征貢獻(xiàn)率為14.75%，2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為81.42%。主成分1中巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖為主要影響因子；主成分2中甘露糖、葡萄糖醛酸為主要影響因子。

根據(jù)得分排序來(lái)看：相對(duì)于主成分1，采自山東菏澤的地參得分最高；相對(duì)于對(duì)主成分2，采自江蘇徐州的地參得分最高；說(shuō)明采自山東菏澤、江蘇徐州單糖成分含量較高。綜合得分排序由高到低依次為：山東菏澤、江蘇徐州、廣西玉林、云南騰沖、重慶萬(wàn)州、云南大理。說(shuō)明地參單糖含量的高低在我國(guó)地域上呈現(xiàn)出北方>南方>西南的趨勢(shì)，這可能與日照時(shí)間、晝夜溫差等因素影響了糖分的積累有關(guān)[23-24]。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)地地參多糖均具有相似的單糖組成，即甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖等，其中半乳糖、葡萄糖為主要成分，但各單糖含量及組成比例有明顯差異。因此，基于地參多糖的特征單糖組分分析研究，有助于完善地參的質(zhì)量控制與開(kāi)發(fā)利用。

本研究建立了水提醇沉法、PMP柱前衍生HPLC法測(cè)定地參多糖中8種單糖組成和含量，該方法的靈敏度高、分離效果好，線性范圍寬、檢出限低，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率良好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于地參樣品中多糖的單糖組成分析及定量測(cè)定，也可為其他藥食同源植物多糖組成研究提供參考。