短花針茅荒漠草原單條土壤線蟲(chóng)分子鑒定方法研究

王嘉寶 孟元 史明易 劉美琪 賈美清 張國(guó)剛

摘 ? ?要：土壤線蟲(chóng)在土壤中具有重要的生態(tài)作用，目前大多通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法研究土壤線蟲(chóng)，但該方法有很多弊端。為了更好地在分子水平上研究土壤線蟲(chóng)群落及其多樣性，對(duì)內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原土壤線蟲(chóng)進(jìn)行了單條線蟲(chóng)的分子鑒定，通過(guò)比較4種不同的DNA提取方法（試劑盒法、凍融法、切割法、切割凍融法），確定了土壤線蟲(chóng)最佳的DNA提取方法為切割凍融法。同時(shí)，選出10對(duì)土壤線蟲(chóng)的通用引物經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)，從10對(duì)引物中篩選出3對(duì)引物（分別為線蟲(chóng)rDNA的18S區(qū)引物G18SU/R18Tyl1、28S區(qū)引物D2A/D3B、ITS區(qū)引物TW81/AB28）能達(dá)到較高的成功率，其中適用于內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原土壤線蟲(chóng)的最佳通用引物是：D2A/D3B（5‘-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3;5‘-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3）。本研究通過(guò)明確短花針茅荒漠草原土壤線蟲(chóng)最佳DNA提取方法和最佳通用引物，為進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在分子水平上進(jìn)行土壤線蟲(chóng)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古;短花針茅荒漠草原;土壤線蟲(chóng);分子鑒定方法

中圖分類號(hào)：S154.5;S154.38+6 ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.02.017

Molecular Identification of Soil Nematodes in Stipa breviflora Desert Steppe

WANG Jiabao1， MENG Yuan1， SHI Mingyi3， LIU Meiqi1， JIA Meiqing2， ZHANG Guogang1

（1.Life Science College， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China; 2.Tianjin Key Laboratory of Water Resources and Environment， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China; 3.School of Geographic and Environmental Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract：Soil nematodes play an important ecological role in soil. At present， the study of soil nematodes mostly uses morphological methods， but this method has many disadvantages. In order to better study the community characteristics and diversity of soil nematodes at the molecular level， the researchers carried out molecular identification of single nematodes on soil nematodes in the desert steppe of Inner Mongolia.We compared a total of four different DNA extraction methods： kit， freeze-thaw， cutting and cutting freeze-thaw， and determined that the best DNA extraction method for soil nematodes is the cutting freeze-thaw method.At the same time， the researchers selected a total of 10 pairs of universal PCR primers for soil nematodes.After repeated verification experiments， 3 pairs of optimal primers were selected from the 10 pairs of primers （18S region primers G18SU / R18Tyl1 and 28S region primer D2A of the rDNA of the nematode， and D3B， ITS region primer TW81 / AB28 respectively）.These 3 pairs of PCR primers can achieve a high success rate of amplification， and the best universal primers for soil nematodes in the Stipa breviflora desert steppe of Inner Mongolia are： D2A / D3B（5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'; 5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'）. In this study， we identified the best DNA extraction method and the best universal primer for soil nematodes in the Stipa breviflora desert steppe， laying a foundation for the further study of soil nematodes at the molecular level by using high-throughput sequencing technology.

Key words： Inner Mongolia; Stipa breviflora desert steppe; soil nematode; molecular identification method

土壤線蟲(chóng)是土壤動(dòng)物的重要組成部分，其廣泛存在于各種土壤中，如草原、森林等[1-3]。土壤線蟲(chóng)不僅能夠促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)，改變土壤理化性質(zhì)，還能影響地上和地下生態(tài)系統(tǒng)[4-6]。其具有種類豐富、繁殖周期較短、對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏感等特點(diǎn)，因此經(jīng)常被用作指示生物來(lái)反映土壤受污染的程度[7]，是土壤指示生物中的典型代表[8]。在土壤線蟲(chóng)的鑒定方面，目前使用最多的是依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征的傳統(tǒng)鑒定方法，不過(guò)這種方法存在許多弊端，如鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確、鑒定速度慢等，同時(shí)也受到了經(jīng)濟(jì)和時(shí)間的成本限制[9]。隨著分子生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始采用分子方法鑒定線蟲(chóng)[10-11]。

在線蟲(chóng)分子鑒定方面，ITS區(qū)對(duì)于線蟲(chóng)屬下種的區(qū)分與鑒定有較好的應(yīng)用[12-14]，如可應(yīng)用于傘滑線蟲(chóng)屬、莖線蟲(chóng)屬的鑒定等[15]。然而ITS序列并不能區(qū)分所有線蟲(chóng)屬下物種，核糖體DNA（rDNA）中除了ITS序列，還有18S rDNA基因和28S rDNA基因中的D2A/D3B區(qū)在線蟲(chóng)的分子鑒定中也具有非常重要的作用[16]。我們?cè)谛螒B(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上，通過(guò)比較4種不同的DNA提取方法和篩選線蟲(chóng)rDNA的ITS區(qū)、18S區(qū)、28S區(qū)通用引物，確定了短花針茅荒漠草原土壤線蟲(chóng)的最佳DNA提取方法和最佳通用引物，為進(jìn)一步在分子水平上研究土壤線蟲(chóng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

樣地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市四子王旗農(nóng)牧科學(xué)院長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站（N41°47′17″，E111°53′46″），海拔高度為1 456 m，所屬氣候?yàn)闇貛Т箨懶詺夂?，平均氣溫?.4 ℃。植被類型為典型荒漠草原，植物組成匱乏，建群種為短花針茅（Stip abreviflora），優(yōu)勢(shì)種為冷蒿（Artemisia ?frigida Willd）和無(wú)芒隱子草（Cleistogenes songorica）。土壤的主要類型為棕鈣土。

1.2 土壤樣品采集和線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定

在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)選擇3塊典型的短花針茅荒漠草原樣地，在每塊樣地內(nèi)分別用土壤環(huán)刀采集0～5 cm、5～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 4層土壤樣品，3次重復(fù)，為了減少土壤線蟲(chóng)空間分布差異所造成的影響，每次重復(fù)對(duì)樣地內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)地上植被類型必須為典型短花針茅荒漠草原群落，取樣后將土壤裝入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

收集線蟲(chóng)的方法為改良的貝爾曼漏斗法，在漏斗中的鐵絲網(wǎng)上放入紗布包裹好的土壤，漏斗上端設(shè)置有60 W的白熾燈，下端裝有帶止水夾的乳膠管，漏斗中加入蒸餾水浸沒(méi)土壤，20 ℃室溫條件下分離，期間不斷加入蒸餾水，經(jīng)過(guò)24 h后，將液體收集到離心管中，65 ℃水浴加熱30 min。將收集好的土壤線蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿中，于倒置顯微鏡及體式顯微鏡下，依據(jù)《中國(guó)土壤動(dòng)物檢索圖鑒》、《植物線蟲(chóng)分類學(xué)》觀察鑒定。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法共鑒定出土壤線蟲(chóng)共計(jì)24個(gè)屬，并以此為試驗(yàn)材料進(jìn)行分子鑒定方法研究。

1.3 土壤線蟲(chóng)的分子鑒定方法

1.3.1 DNA提取方法 ? ?在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，將形態(tài)學(xué)鑒定出來(lái)的土壤線蟲(chóng)進(jìn)行分類。由于土壤線蟲(chóng)的體壁較厚，為其DNA的提取增加了難度。因此，如何高效地提取土壤線蟲(chóng)DNA便成為實(shí)現(xiàn)分子鑒定的關(guān)鍵。本項(xiàng)研究為了獲得最佳DNA提取濃度，共設(shè)置4種DNA提取方法[17]，方法如下。

（1）試劑盒法。采用柱式抽提試劑盒直接提取線蟲(chóng)DNA。

（2）凍融法。挑取傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定分類的單條線蟲(chóng)，用滅菌去離子水將線蟲(chóng)清洗干凈，將清洗干凈的線蟲(chóng)放入200 μL PCR管中，PCR管中加入8 μL去離子水，放入離心機(jī)瞬時(shí)離心5 s，取出PCR管后放入液氮中1 min，迅速轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴鍋中2 min，重復(fù)3次，最后加入蛋白酶裂解液2 μL，56 ℃保溫1 h，95 ℃加熱10 min。

（3） 切割法。挑取傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定分類的單條線蟲(chóng)，用滅菌去離子水將線蟲(chóng)清洗干凈，放入含8 μL滅菌去離子水的200 μL PCR管中，放入離心機(jī)瞬時(shí)離心5 s，取出后將PCR管外壁擦拭干凈，在顯微鏡下用小型解剖針將PCR管內(nèi)的線蟲(chóng)切開(kāi)，最后加入蛋白酶裂解液2 μL，56 ℃保溫1 h，95 ℃加熱10 min。

（4）切割凍融法。挑取傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定分類的單條線蟲(chóng)，用滅菌去離子水將線蟲(chóng)清洗干凈，放入含8 μL滅菌去離子水的200 μL PCR管中，放入離心機(jī)瞬時(shí)離心5 s，取出后將PCR管外壁擦拭干凈，在顯微鏡下用小型解剖針將PCR管內(nèi)的線蟲(chóng)切開(kāi)，放入離心機(jī)瞬時(shí)離心5 s，取出后將PCR管放入液氮中1 min，迅速轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴鍋中2 min，重復(fù)3次，最后加入蛋白酶裂解液2 μL，56 ℃保溫1 h，95 ℃加熱10 min。

1.3.2 引物篩選 ? ?經(jīng)查閱文獻(xiàn)[18-27]，本研究利用線蟲(chóng)核糖體DNA的ITS區(qū)、18S區(qū)、28S區(qū)具有種內(nèi)高度保守、種間變化大且受環(huán)境變化影響較小的特點(diǎn)，在線蟲(chóng)rDNA的ITS區(qū)、18S區(qū)和28S區(qū)的高保守區(qū)篩選出10對(duì)土壤線蟲(chóng)通用引物，用于確定內(nèi)蒙古荒漠草原土壤線蟲(chóng)分子方法鑒定的最佳引物。10對(duì)通用引物序列如表1所示。

由于引物不同，選擇相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件也不同，用以下體系及反應(yīng)條件為核心反應(yīng)體系和模板，根據(jù)不同引物在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。

PCR擴(kuò)增體系：模板DNA10 μL，10×PCR Buffer （Mg2+） 5 μL，2 μL dNTP （2.5 mmol·L-1），1 μL引物F （10μmol·L-1），1μL引物R（10μmol·L-1）;rTaq DNA 聚合酶（5U·L-1）0.4 μL;模板DNA 10 μL;無(wú)菌ddH2O 30.6 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性40 s;55 ℃退火40 s;72 ℃ 延伸 1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，檢測(cè)合格后送樣測(cè)序。

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 短花針茅荒漠草原土壤線蟲(chóng)DNA提取的最佳方法

用4種不同的方法對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定得到的24個(gè)屬的線蟲(chóng)進(jìn)行了DNA提取，以研究柱式抽提試劑盒、凍融法、切割法、切割凍融法對(duì)土壤線蟲(chóng)DNA的提取效果，采用D2A/D3B作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于該引物只能擴(kuò)增出24個(gè)屬中的22個(gè)，所以只能應(yīng)用這對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增22個(gè)屬的DNA，來(lái)研究最佳的DNA提取方法，研究結(jié)果如下。

由圖1可見(jiàn)，柱式抽提試劑盒提取DNA的效率很低，對(duì)于大多數(shù)土壤線蟲(chóng)屬都不能提取，用柱式抽提試劑盒只能提取出麗突屬、擬麗突屬線蟲(chóng)DNA，且提取濃度和成功率都很低。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，由柱式抽提試劑盒提取DNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果會(huì)有雜帶，測(cè)序成功率低。

由圖2可知，凍融法提取DNA的效率有所提升，能提取出麗突屬、擬麗突屬、鹿角唇屬、滑刃屬、真滑刃屬線蟲(chóng)的DNA，提取濃度有所升高。但是成功率依然很低，而且凍融法提取的DNA測(cè)序結(jié)果仍有雜帶，測(cè)序成功率不高。

由如圖3可見(jiàn)，切割法提取的DNA的效率升高，能提取出20個(gè)屬的DNA，且提取的DNA濃度很高，測(cè)序結(jié)果仍有雜帶，但測(cè)序成功率有所升高。

應(yīng)用切割凍融法提取22個(gè)屬的rDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

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