搖瓶法培養(yǎng)甲烷氧化菌吸附甲烷氧化菌素的研究

張 帥，郝 雪，王 悅，辛嘉英

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

甲烷氧化菌(Methanotroph)是廣泛存在于自然界中的一種能夠以甲烷、甲醇等單碳化合物為碳源來(lái)進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物[1]，它對(duì)于改善大氣中甲烷的平衡具有重要意義，可以預(yù)防并阻止日趨嚴(yán)重的溫室效應(yīng).此外，大量研究表明，甲烷氧化菌在生物可降解塑料、單細(xì)胞蛋白的合成、食品抗氧化劑、食品安全檢測(cè)、三氯乙烯等有機(jī)成分的降解以及提供清潔能源等方面也表現(xiàn)出了相當(dāng)大的潛力[2～5].甲烷氧化菌的代謝主要依靠一種叫甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)的物質(zhì)，甲烷在它的作用下被催化氧化而生成甲醇[6].甲醇脫氫酶(Methanol dehydrogenase，MDH)又將生成的甲醇繼續(xù)氧化成甲醛，依賴(lài)于甲醛脫氫酶(Formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)DAH)和甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)的作用最終使甲醛徹底氧化分解為CO2和H2O，同時(shí)通過(guò)絲氨酸循環(huán)或磷酸戊糖途徑完成細(xì)胞合成，為細(xì)胞代謝提供還原物質(zhì)[7].

在甲烷氧化菌的研究中發(fā)現(xiàn)存在一種小分子的熒光肽，它以分泌物的形式存在于甲烷氧化菌細(xì)胞外，同時(shí)又可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)膜參與顆粒性甲烷單加氧酶的形成[8].2004年這種熒光肽的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)被發(fā)表，由7個(gè)氨基酸組成，包含2個(gè)咪唑N和2個(gè)硫酰S的硫酰咪唑基團(tuán)，可以與銅離子發(fā)生絡(luò)合[9].2008年該結(jié)構(gòu)又被進(jìn)行了部分修正，原來(lái)的羥咪唑基團(tuán)更改為酮咪唑基團(tuán)，異丙酯結(jié)構(gòu)更改為甲基丁?；Y(jié)構(gòu).從此以后，該物質(zhì)也就被命名為甲烷氧化菌素(methanobacin, mb)[10].甲烷氧化菌素對(duì)銅具有較強(qiáng)的親和性，2004年Kim等人在研究甲烷氧化菌素結(jié)合銅的機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)低濃度Cu有利于促進(jìn)甲烷氧化菌素的積累.當(dāng)提供大量的Cu時(shí)，會(huì)促使甲烷氧化菌素與pMMO結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)膜上[11].另外，甲烷氧化菌素∶Cu=1∶1時(shí)，甲烷氧化菌素促進(jìn)甲烷氧化菌的生長(zhǎng).同時(shí)，顆粒性甲烷單加氧酶一旦與甲烷氧化菌素分離，顆粒性甲烷單加氧酶會(huì)喪失活性，生長(zhǎng)受到抑制.分析其原因，甲烷氧化菌可能會(huì)像其他能分泌嗜鐵素(siderophore)用于捕獲環(huán)境中鐵的細(xì)菌一樣具有捕獲銅的能力，而這種能力就來(lái)源于甲烷氧化菌素[12].此后，Choi等發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌細(xì)胞外的甲烷氧化菌素在結(jié)合銅后返回細(xì)胞內(nèi)膜，參與顆粒性甲烷單加氧酶的催化氧化過(guò)程.加快了反應(yīng)中電子的流動(dòng)性.甲烷氧化菌素還具有過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性，說(shuō)明甲烷氧化菌素在顆粒性甲烷單加氧酶的催化氧化過(guò)程中將NADH等電子供體向顆粒性甲烷單加氧酶?jìng)鬟f，清除氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[13].通過(guò)改變搖瓶法培養(yǎng)甲烷氧化菌的條件，采用大孔樹(shù)脂法對(duì)甲烷氧化菌素的靜態(tài)吸附及動(dòng)態(tài)吸附后分離純化甲烷氧化菌素，找到最佳吸附甲烷氧化菌素效果，有望為甲烷氧化菌OB3b應(yīng)用提供理論參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

立式高壓滅菌器(上海申安LDZX-50KB型)；恒溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子HZQ-D型)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津UV-2550型)；高速離心機(jī)(德國(guó)賀默公司Z-366)；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

甲烷氧化菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)，由清華大學(xué)邢新會(huì)教授贈(zèng)送；NMS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[14]方法配制；甲烷(北京海普氣體有限公司)；大孔樹(shù)脂；甲醇，K2HPO4，KH2PO4·7H2O，NH4Cl，KNO3，硫酸銅等均為分析純(天津市天力化學(xué)試劑有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 搖瓶法培養(yǎng)甲烷氧化菌

培養(yǎng)基選用甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)甲烷氧化菌OB3b，定容至3 L的容量瓶.用紗布和報(bào)紙包扎瓶口，將上述物品放入高壓滅菌鍋中滅菌，121 ℃滅菌20 min后，置于無(wú)菌操作臺(tái)上冷卻.按照10%接種量接種，用帶棉花的玻璃管膠塞封口.以甲烷作為碳源培養(yǎng)，采用真空抽氣法抽氣后置入甲烷.溫度30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷.

1.3.2 甲烷氧化菌素的制備分離純化

離心取上清液，柱層析前對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行活化，過(guò)柱后用60%甲醇洗脫大孔樹(shù)脂中吸附的甲烷氧化菌素，將裝有甲烷氧化菌素提取液的燒瓶40 ℃，130 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋蒸多余的甲醇樣品冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素.

1.3.3 不同裝液量對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附培養(yǎng)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

分別于3 L玻璃搖瓶中配制裝液量為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L的不同體積的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，加入等量已處理好的大孔樹(shù)脂.121 ℃滅菌20 min后按照10%接種量接種.30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出3 mL菌液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)菌液600 nm吸光值.

1.3.4 不同裝液量對(duì)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附培養(yǎng)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

分別于3 L玻璃搖瓶中配制裝液量為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L的不同體積的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，不加入大孔樹(shù)脂.121 ℃滅菌20 min后按照10%接種量接種.30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出3 mL菌液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)菌液600 nm吸光值.

1.3.5 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附法對(duì)吸附甲烷氧化菌素的影響

分別配制5瓶1.5 L的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基各加入等量已處理好的大孔樹(shù)脂，按照10%接種量接種甲烷氧化菌OB3b，30 ℃，180 r/min空氣浴搖床中培養(yǎng)，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出1瓶菌液對(duì)其產(chǎn)生甲烷氧化菌素進(jìn)行分離純化，用紫外分光光度計(jì)掃描全波長(zhǎng)，計(jì)算甲烷氧化菌素的濃度.

1.3.6 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附法對(duì)吸附甲烷氧化菌素的影響

分別配制5瓶1.5 L的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，按照10%接種量接種甲烷氧化菌OB3b，30 ℃，180 r/min空氣浴搖床中培養(yǎng)，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出1瓶菌液對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行分離純化產(chǎn)生甲烷氧化菌素，用紫外分光光度計(jì)掃描全波長(zhǎng)，計(jì)算甲烷氧化菌素的濃度.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同裝液量對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附下甲烷氧化菌的生長(zhǎng)結(jié)果

如圖1、2所示，1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L五種不同裝液量的培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)條件下，分別進(jìn)行1～5 d的培養(yǎng)后，可以看出1.2、1.3 L裝液量的甲烷氧化菌OB3b吸光值增加并不明顯，說(shuō)培養(yǎng)基裝液量不足導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足甲烷氧化菌OB3b的生長(zhǎng)需求而生長(zhǎng)緩慢；而1.4、1.5 L隨著裝液量的升高，菌體生長(zhǎng)加快；1.6 L時(shí)，菌體生長(zhǎng)反而下降，說(shuō)明裝液量過(guò)多，導(dǎo)致留給菌體進(jìn)行有氧呼吸的空間被縮小，抑制了菌體生長(zhǎng).故當(dāng)培養(yǎng)基用量為1.5 L時(shí)，甲烷氧化菌OB3b的生長(zhǎng)情況最好.另外，對(duì)比大孔樹(shù)脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附下培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長(zhǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的培養(yǎng)方式也優(yōu)于動(dòng)態(tài)吸附.

圖1 不同裝液量在大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附方式培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長(zhǎng)曲線

圖2 不同裝液量在大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附方式培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長(zhǎng)曲線

2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附法對(duì)吸附甲烷氧化菌素的影響結(jié)果

如圖3、4所示，1.5 L的培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)條件下，分別進(jìn)行1～5 d的培養(yǎng)后，可以看出，培養(yǎng)1～4 d所得到的甲烷氧化菌素進(jìn)行紫外分光光度計(jì)的全波長(zhǎng)掃描后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，甲烷氧化菌素在394 nm最大吸收峰對(duì)應(yīng)增加，說(shuō)明隨著甲烷氧化菌OB3b的生長(zhǎng)速度加快，菌體數(shù)量增多，其向胞外釋放的甲烷氧化菌素量也逐漸增多，隨即很快就被培養(yǎng)基中的大孔樹(shù)脂所吸附.培養(yǎng)4 d后，甲烷氧化菌素開(kāi)始減少，可能是由于在發(fā)酵液中甲烷氧化菌數(shù)量已達(dá)到最大值，部分菌體出現(xiàn)死亡，部分甲烷氧化菌素發(fā)生裂解破碎而無(wú)法被檢測(cè)到.故選擇4 d為甲烷氧化菌OB3b最佳吸附甲烷氧化菌素的培養(yǎng)時(shí)間.

圖3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附甲烷氧化菌素的全波長(zhǎng)掃描

通過(guò)靜、動(dòng)態(tài)兩種吸附方式比較發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)吸附培養(yǎng)時(shí)，隨著時(shí)間的遞增，甲烷氧化菌素的394 nm吸收峰明顯.而在相同培養(yǎng)條件下動(dòng)態(tài)吸附?jīng)]有明顯的吸收峰，說(shuō)明靜態(tài)吸附培養(yǎng)條件下，更多的甲烷氧化菌素被吸附進(jìn)入大孔樹(shù)脂而最后被分離出來(lái).因此從紫外分光光度計(jì)檢測(cè)甲烷氧化菌素含量的角度來(lái)說(shuō)，靜態(tài)吸附要優(yōu)于動(dòng)態(tài)吸附.

圖4 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附甲烷氧化菌素的全波長(zhǎng)掃描

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲烷氧化菌OB3b在大孔樹(shù)脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附法的培養(yǎng)方式下，考察不同裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附法對(duì)吸附甲烷氧化菌素的影響.結(jié)果表明，培養(yǎng)基裝液量為1.5 L時(shí)，培養(yǎng)4 d，大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的培養(yǎng)方式對(duì)甲烷氧化菌OB3b的生長(zhǎng)較好.同時(shí)，靜態(tài)吸附下，大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附甲烷氧化菌素的量也更多，為今后提高甲烷氧化菌素的分離能力奠定了科學(xué)基礎(chǔ).