朱娟娟,崇慧峰,胡志軍,吳寶明,潘曉龍,李旭光,唐吉斌
腦血管病是我國成年人致死和致殘的首位原因,《中國腦卒中防治報告2018》概要指出,由于社會老齡化及不健康生活方式的流行,我國腦卒中有爆發(fā)式增長的態(tài)勢,并且呈現(xiàn)出性別和地域差異明顯以及年輕化的趨勢[1]。血液中同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平增高被認為是腦卒中發(fā)病的風險因素之一[2],其水平的增高受非遺傳因素和遺傳因素的影響:葉酸缺乏及糖攝入增加是常見的導致Hcy水平增高的非遺傳因素,而5,10-亞甲基四氫葉 酸 還 原 酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)活性下降是導致Hcy水平增高的主要遺傳性因素之一[3]。
MTHFR是Hcy代謝與葉酸代謝中的關(guān)鍵酶,它可催化5,10-亞甲基四氫葉酸使血中Hcy 發(fā)生甲基化,維持其在血中的水平。MTHFR C677T基因多態(tài)性是由第677 位的點突變導致的,突變導致的酶活性下降可引起高Hcy血癥[4]。
目前關(guān)于MTHFR C677T 基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系越來越引起人們的重視,但由于其基因分布頻率受地域和種族影響[5],研究結(jié)果尚有爭議,本研究以銅陵地區(qū)腦卒中人群作為研究對象,分析該人群MTHFR C677T基因多態(tài)性分布及Hcy水平,探討腦卒中發(fā)生的風險因素并為其個體化防治提供依據(jù)。
1.1 一般資料 選取2017年10月到2019年4月銅陵市人民醫(yī)院住院的腦卒中病人234 例為研究對象,均為長期居住本地的漢族人。經(jīng)頭顱CT或MRI檢查,符合中華醫(yī)學會第四屆全國腦血管病學術(shù)會議提出的各項腦血管病診斷標準,其中出血性腦卒中82 例,缺血性腦卒中152 例;男性140 例,女性94例;年齡范圍為23~92歲,年齡69歲,234例病人均進行MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測,其中227例進行了Hcy檢測。選取同時間段無冠心病、高血壓、腦血管病于醫(yī)院其他科室69例住院病人為對照組,其中男性35例,女性34例;年齡范圍為22~88歲,年齡55 歲,69 例對照組均進行MTHFR C677T 基因多態(tài)性檢測,其中67例進行了Hcy檢測。記錄研究對象身高、體質(zhì)量、有無高血壓史,并計算體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index,BMI)。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。
1.2 主要儀器與試劑 PyroMark Q24 焦磷酸測序儀(德國凱杰公司),高速低溫離心機(德國赫擔馳公司),基因擴增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司),全血基因組提取試劑盒及測序反應通用試劑盒(長沙三濟公司),基因擴增試劑(日本Takara 公司),擴增引物(上海捷瑞生物工程有限公司),全自動生化分析儀(德國西門子公司),Hcy 檢測試劑盒(安徽大千生物工程有限公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 標本采集 清晨采集受試者空腹靜脈血標本,乙二胺四乙酸二鉀鹽(EDTA dipotassium salt,EDTA-K2)抗凝血2 mL 用于基因測序,未抗凝血2 mL待充分凝固后離心留取血清用于Hcy檢測。
1.3.2 全血基因組DNA 提取 采用柱式法從外周血細胞中將基因組DNA提取純化,嚴格按照試劑盒說明書進行操作,提取后的DNA 可短期保存于2~8 ℃或長期凍存于-20 ℃和-80 ℃。
1.3.3 PCR 擴增 PCR 擴增反應體系含樣本DNA 2 μL、Taq 酶0.5 μL、正向引物和反向引物各1 μL、緩沖液5μL、dNTP 3μL,最后用純水補足總反應體系50μL。擴增條件為:94 ℃5 min,94℃25 s,56 ℃25 s,72 ℃25 s,共35 個循環(huán),72 ℃5 min 后擴增產(chǎn)物可進行測序。
1.3.4 基因測序 通過PyroMark Q24MDx系統(tǒng)采用焦磷酸測序法測定MTHFR C677T位點,確定各樣本基因型。
1.3.5 Hcy檢測 酶循環(huán)法檢測血清Hcy水平。
1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析,定性資料的描述使用百分比,統(tǒng)計推斷使用χ2檢驗,定量資料不服從正態(tài)分布時,統(tǒng)計描述使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距,三樣本之間的比較使用Kruskal-Wallis H檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義,兩樣本之間的比較使用Mann-Whitney U 檢驗,組間兩兩比較時校正后的檢驗水準α=0.05/3=0.017,同時以Hcy 為因變量進行多元線性回歸分析,評價基因型、性別、年齡、BMI等對Hcy水平的影響。
2.1 MTHFR C677T 基因型檢測結(jié)果分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)焦磷酸測序后,儀器測得峰高與檢測位點結(jié)合模板的堿基數(shù)量成正比,經(jīng)軟件處理后自動轉(zhuǎn)化為序列信息,確定該樣本攜帶的基因型。見圖1。
圖1 MTHFR C677T基因測序結(jié)果分析圖:A為野生純合型(CC),B為雜合突變型(CT),C為純合突變型(TT)
2.2 MTHFR C677T 基因型頻率及等位基因頻率 如表1所示,本研究中腦卒中組MTHFR C677T的野生純合基因型(CC)、雜合突變型基因型(CT)和純合突變型基因型(TT)的分布頻率分別為31.2%、48.7%和20.1%,腦卒中組TT 基因型頻率高于對照組TT基因型頻率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而CC、CT 基因型頻率在兩組中分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);腦卒中組和對照組T等位基因分布頻率分別為44.4%和33.3%,腦卒中組T等位基因分布頻率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如表2 所示,在腦卒中組中,不同性別的病人MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表1 MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布頻率/例(%)
表2 MTHFR C677T 基因型在不同性別腦卒中病人中的分布頻率/例(%)
2.3 MTHFR C677T 基因型與Hcy 水平的相關(guān)性 如表3 所示,在腦卒中組中,TT 基因型病人的Hcy 水平高于CC 基因型和CT 基因型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而對照組三種不同基因型之間Hcy 水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。將腦卒中組和對照組同種基因型的Hcy 水平進行比較,可以看出腦卒中組Hcy 水平均增高,其中TT 基因型的Hcy水平在兩組間有差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表3 MTHFR C677T 基因型與血清Hcy水平的關(guān)系/(μmol/L)
2.4 Hcy水平與其他變量的多元線性回歸 以Hcy為因變量,MTHFR C677T 不同基因型、性別、年齡、有無高血壓史和BMI 為自變量進行的多元逐步分析結(jié)果顯示,僅基因型、性別、高血壓史與Hcy 存在顯著的線性關(guān)聯(lián),回歸結(jié)果見表4,當基因型由野生型(CC)向雜合突變(CT)及純合突變(TT)的轉(zhuǎn)化時,Hcy水平也會隨之增加,男性和有高血壓的病人Hcy水平也會增加。
表4 影響同型半胱氨酸水平的多元線性回歸分析
腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復發(fā)率高的特點[6],可造成個人及國家的大量醫(yī)療支出,如能采取有效的措施早期干預其發(fā)病的危險因素,可顯著降低致殘率和致死率。
血液中高濃度的Hcy 會干擾血管內(nèi)皮細胞功能,導致凝血和纖溶系統(tǒng)異常,使機體處于血栓前狀態(tài),也可作用于內(nèi)皮細胞,使血管收縮,血壓上升,促使動脈粥樣硬化形成,增加腦血管病的發(fā)生風險[4]。有研究認為高Hcy血癥是獨立于高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙和年齡之外,引發(fā)心血管疾病的一個獨立的危險因素[7]。但也有文獻指出目前國外的許多心血管疾病指南均未把高Hcy血癥作為心血管病的危險因素,并不贊同高Hcy血癥是心腦血管疾病的獨立危險因素的說法[8]。總體來說,國內(nèi)的大多研究認為高Hcy血癥是影響高血壓病人心血管病預后的重要危險因素[9]。降低血中Hcy水平可有效減低腦卒中的發(fā)病風險且改善急性腦梗死病人預后[10-11]。
MTHFR 是影響血中Hcy 水平的主要遺傳性因素之一,它是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶[12],MTHFR C677T是目前研究最多的基因多態(tài)位點,由于第677位的堿基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置換導致,導致其編碼產(chǎn)物由丙氨酸被纈氨酸替代,從而影響酶的活性。這種點突變可產(chǎn)生三種基因型,分別是野生純合型CC,雜合突變型CT,純合突變型TT,CT型的酶活性是CC 型的65%,TT 型的活性僅為CC 型的30%[13]。目前,MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦卒中相關(guān)性的研究很多:Li 等[14]指出中國人群MTHFR C677T 基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病相關(guān),可能是由于其影響血中Hcy 水平所致;Zhao 等[15]認為在中國高血壓病人中,MTHFR C677T基因型和葉酸補充與Hcy 對第一次卒中的影響密切相關(guān),而且葉酸干預能顯著降低CC和CT基因型病人由高Hcy導致的卒中風險,提示可根據(jù)個體遺傳背景和營養(yǎng)狀況對腦卒中進行防治;張露等[16]卻認為MTHFR C677T 基因突變可能與缺血性腦卒中無關(guān);王超等[17]的研究也表明MTHFR C677T 基因在腦卒中組和健康人群組中的分布沒有差異。造成研究結(jié)果差異的原因可能是由于研究樣本量和分析方法不同導致,也有可能是研究人群具有不同遺傳背景和營養(yǎng)狀況導致,據(jù)報道中國人群具有較高的MTHFR C677T的突變頻率[13],且由于飲食烹飪習慣的原因?qū)е麓蟛糠种袊赡耆耍ㄓ绕湓诒狈剑┤~酸攝入較低[1],會導致較高的Hcy水平和腦卒中發(fā)病風險。
本研究中安徽銅陵地區(qū)腦卒中人群MTHFR C677T突變的T等位基因頻率為45.1%,低于黑龍江地區(qū)[17],高于廣州地區(qū)[18],說明該基因有一定的地域特點。腦卒中組MTHFR C677T 突變基因T 的頻率高于對照組,提示在銅陵地區(qū)腦卒中可能與MTHFR C677T基因多態(tài)性相關(guān)。有報道指出MTHFR C677T 基因多態(tài)分布有性別差異[19],但本研究中并未體現(xiàn)。在將腦卒中組和對照組進行同種基因型Hcy 水平的比較時發(fā)現(xiàn),腦卒中組均具有較高的Hcy水平,尤其TT基因型Hcy水平增高差異有統(tǒng)計學意義,提示當TT基因型和高Hcy的同時存在時腦卒中有較高的發(fā)病風險。腦卒中組三種基因型中TT基因型的Hcy水平高于其他兩種基因型,可能是由于純合突變的基因?qū)е旅富钚悦黠@下降所致。對影響Hcy水平的其他因素進行多元線性回歸結(jié)果顯示,除了MTHFR C677T 的基因型,性別及高血壓史也會對Hcy 水平造成一定影響,這也就解釋了對照組三種基因型之間Hcy 水平無明顯差異的原因,除了MTHFR C677T基因多態(tài)性,Hcy水平還可能受性別和血壓情況等多種因素的影響。由于本研究是回顧性研究,研究對象葉酸攝取情況無法獲得,因此進一步擴大研究樣本量并對病人葉酸攝取情況進行問卷調(diào)查是我們接下來要做的工作。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,銅陵地區(qū)腦卒中病人具有較高的MTHFR C677T基因的突變頻率和Hcy水平,可能是腦卒中發(fā)病的風險因素。進行MTHFR C677T基因多態(tài)性和Hcy水平的檢測有助于篩選腦卒中高危人群,并有望根據(jù)基因型及Hcy水平進行不同劑量的葉酸補充,即個體化地指導腦卒中的一級預防和藥物治療,可極大地減輕病人和社會的負擔。