雄性大鼠盆神經(jīng)損傷神經(jīng)源性膀胱動物模型的建立

葛慶宇，肖峻，沈洲

近年來，由于診療技術(shù)的不斷提高，更多的盆腔腫瘤如卵巢癌、直腸癌及前列腺癌等在疾病早期即可被發(fā)現(xiàn)和診斷，并接受根治性手術(shù)治療［1］。然而，盆腔根治術(shù)中為了使病人獲得更高的術(shù)后生存率，手術(shù)范圍相對較大，極易造成神經(jīng)的牽拉、壓迫、電刀灼熱傷以及局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其中就包括了支配膀胱功能的自主神經(jīng)的損傷［2-3］。自主神經(jīng)又分為腹下神經(jīng)和盆內(nèi)臟神經(jīng)，神經(jīng)交叉走形之后匯合成盆叢。Aizawa等［4］發(fā)現(xiàn)盆神經(jīng)損傷后可導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮無力，同時伴有膀胱敏感度下降，從而引起膀胱排空障礙及尿潴留的發(fā)生，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量。因此，盆腔根治術(shù)后所致的神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是一個亟待解決的醫(yī)學(xué)難題，近些年來越來越被重視。我們自2017 年6 月至2018 年6 月建立了一種盆神經(jīng)損傷后的神經(jīng)源性膀胱動物模型，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠（8 周齡；n＝16），體質(zhì)量為250～300 g，在光照/黑暗周期為12 h、自由飲水和定期提供食物的條件下飼養(yǎng)。本研究中所有動物均由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心所提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將16只大鼠隨機(jī)分為兩組：A為神經(jīng)損傷組（n＝8），損傷雙側(cè)盆神經(jīng)；B為假手術(shù)組（n＝8），顯露但不損傷盆神經(jīng)。

1.2 建模方法 10%水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定大鼠，取下腹部正中切口，在手術(shù)顯微鏡下于前列腺背外側(cè)顯露大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)節(jié)，游離顯露大鼠盆神經(jīng)，血管鉗鉗夾2 min造成神經(jīng)損傷大鼠模型。假手術(shù)組顯露雙側(cè)盆神經(jīng)但不損傷。檢查大鼠腹腔內(nèi)無活動性出血后逐層縫合關(guān)腹。每日定時進(jìn)行人工擠尿，將大鼠抓起使之直立位后，兩手食指從上向下擠壓腹部到大鼠骨盆處，重復(fù)動作3次。

1.3 清醒狀態(tài)下大鼠膀胱功能檢測 術(shù)后4周，參照Gao W 的方法對兩組大鼠進(jìn)行尿動力學(xué)檢測［5］。將大鼠以10%水合氯醛麻醉，取腹部正中切口，5F聚乙烯導(dǎo)管插入膀胱的頂部，并用荷包縫合適當(dāng)固定。將導(dǎo)管從皮下穿過并用縫線固定在背部皮膚上，以防止導(dǎo)管被大鼠拉拽。微量注射泵、壓力傳感器與T形管相連，排空空氣后，將壓力傳感器連接至BL-420 生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（生物信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)BL-420，成都泰盟科技有限公司，成都，中國），并進(jìn)行調(diào)零。將大鼠置于限制籠內(nèi)，待麻醉完全清醒后，輕壓下腹部排空膀胱，調(diào)節(jié)灌注泵以0.2 mL/min速度向大鼠膀胱內(nèi)灌注室溫下的生理鹽水，在尿液漏出時停止灌注，尿道口首次流出液體時的灌注容積記為膀胱最大容量。觀察BL-420 系統(tǒng)中記錄出的膀胱壓力曲線，記錄最大膀胱排尿壓（MVP）。重復(fù)以上操作3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 組織學(xué)檢測 膀胱測壓后，取兩組大鼠膀胱稱重，之后取材部分膀胱壁組織以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備成厚約6μm的石蠟切片，分別進(jìn)行Masson 染色和VAChT 免疫熒光染色。Masson染色切片于顯微鏡下觀察并拍照，藍(lán)染的為膠原成分，紅染的為平滑肌。VAChT免疫熒光染色步驟：使用修飾的檸檬酸鹽緩沖液（Target Rretrieval solution；Dako，carpinteria，CA，USA）進(jìn)行抗原修復(fù)并且淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。切片經(jīng)3%山羊血清封閉，0.3%Triton X-100破膜后，加入VAChT抗體（1∶50；Mouse；Santa Cruz）4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后，加入二抗羊抗兔，室溫孵育1 h，PBS 漂洗。PBS漂洗后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

利用Image Pro Plus 圖像分析軟件計算出各組大鼠膀胱逼尿肌組織Masson 染色切片中膠原纖維的面積比值和VAChT 免疫熒光染色切片中VAChT陽性神經(jīng)纖維占比，組間進(jìn)行比較。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 術(shù)后4 周，神經(jīng)損傷組8 只大鼠中其中1只因切口感染合并血尿而死亡，存活7只；假手術(shù)組8 只大鼠均存活。取得膀胱組織，神經(jīng)損傷組大鼠膀胱體積明顯大于假手術(shù)組，神經(jīng)損傷組大鼠膀胱質(zhì)量（123.6±16.8）mg較假手術(shù)組（87.2±11.2）mg明顯增加（t＝5.099，P＝0.000）。

2.2 膀胱功能檢測 膀胱功能檢測中測得損傷組大鼠膀胱最大容量（3.45±0.45）mL 較假手術(shù)組（1.46±0.11）mL明顯增加（t＝12.150，P＝0.000）。

圖1是兩組大鼠在清醒狀態(tài)下膀胱最大排尿壓（MVP）的結(jié)果。從圖中可以看出損傷組大鼠排尿壓上升幅度很小，其峰值為（12.1±6.5）mmHg，而假手術(shù)組大鼠膀胱內(nèi)壓在排尿前達(dá)峰值為（42.9±10.5）mmHg。因此，損傷組大鼠最大排尿壓較假手術(shù)組明顯降低（t＝7.054，P＝0.000）。

2.3 組織學(xué)結(jié)果 如圖2所示，膀胱組織的Masson染色顯示神經(jīng)損傷組（19.75±5.46）%的膠原沉積面積比例較假手術(shù)組（9.95±3.25）%明顯增多（t＝4.362，P＝0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示損傷組（7.46±1.68）%VAChT 陽性神經(jīng)纖維占比較假手術(shù)組（12.67±3.24）%明顯減少（t＝4.038，P＝0.001）。

圖2 兩組膀胱壁組織Masson染色照片（×200）和VAChT陽性神經(jīng)纖維免疫熒光染色照片（×400）：A和C為神經(jīng)損傷組；B和D為假手術(shù)組（A和B Masson染色：藍(lán)染的為膠原，紅染的為平滑?。籆和D免疫熒光染色：紅染的為VAChT陽性神經(jīng)纖維，藍(lán)染的為胞核）

3 討論

神經(jīng)源性膀胱是由于神經(jīng)控制機(jī)制出現(xiàn)紊亂而導(dǎo)致的下尿路功能障礙，通常需在存有神經(jīng)病變的前提下才能診斷［6］。病因包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)因素、外周神經(jīng)系統(tǒng)因素、感染性疾病、醫(yī)源性因素，其中盆腔根治性手術(shù)是最常見的醫(yī)源性因素。研究顯示50%以上的直腸癌經(jīng)腹會陰直腸切除術(shù)病人術(shù)后會出現(xiàn)下尿路功能障礙，主要原因是手術(shù)過程中損傷了盆神經(jīng)支配逼尿肌的纖維［7］。Katepratoom 等［8］的一項調(diào)查顯示，約62.9%的病人在根治性子宮切除術(shù)后出現(xiàn)儲尿期癥狀，如尿頻、尿急、尿失禁等，42.9%的病人伴有排尿期癥狀，如排尿困難，尿潴留等。因此，建立盆腔根治術(shù)后的神經(jīng)源性膀胱動物模型對于研究此類疾病和如何提升病人生活質(zhì)量意義深遠(yuǎn)。

Hannan等［9］曾通過夾閉雌性大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)叢發(fā)出支配膀胱神經(jīng)15 s×3 次建立神經(jīng)源性膀胱模型，結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后導(dǎo)致大鼠逼尿肌收縮力受損，逼尿肌纖維化。但由于夾閉時間較短，神經(jīng)損傷可能不徹底，從而導(dǎo)致神經(jīng)自我修復(fù)，以至恢復(fù)部分膀胱功能，影響實驗結(jié)果，因此本實驗通過延長夾閉時間至2 min，以消除客觀因素可能對實驗結(jié)果帶來的影響。并且，雌性大鼠盆神經(jīng)缺乏典型解剖標(biāo)志，建立統(tǒng)一的模型較為困難，而雄性大鼠盆神經(jīng)解剖標(biāo)志明確，位于膀胱內(nèi)上方、前列腺背外側(cè)，由盆神經(jīng)節(jié)發(fā)出，因此，本研究選用雄性SD大鼠研究，操作步驟較為簡單，大鼠模型統(tǒng)一可靠。此外，長期以來神經(jīng)源性膀胱動物模型的建立多選擇Hassan Shaker脊髓橫斷法［10］，本研究采用的模型制備方案的優(yōu)勢在于：①本研究術(shù)后大鼠不會出現(xiàn)雙后肢屬于拖行狀態(tài)不能參與行走的情況，避免了褥瘡的發(fā)生；②雙側(cè)盆神經(jīng)損傷更符合臨床盆腔根治術(shù)后神經(jīng)源性膀胱的發(fā)生情況，更具臨床意義；③本研究術(shù)后大鼠避免了繼發(fā)性脊髓感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，降低了術(shù)后護(hù)理難度及減少了大鼠死亡率。

盆腔根治術(shù)后神經(jīng)源性膀胱的根本原因在于逼尿肌纖維化，即大量膠原纖維沉積、平滑肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致膀胱順應(yīng)性下降，逼尿肌收縮無力，因而出現(xiàn)膀胱貯尿和排空障礙。本研究中，損傷組大鼠最大排尿壓較假手術(shù)組明顯降低，表明盆神經(jīng)損傷后大鼠逼尿肌收縮力明顯受損。Masson 染色示神經(jīng)損傷組逼尿肌中平滑肌減少而膠原含量增加，逼尿肌發(fā)生纖維化，免疫熒光示膽堿能（VAChT）陽性神經(jīng)纖維明顯減少，功能學(xué)和形態(tài)學(xué)均符合神經(jīng)源性膀胱的特征。

眾所周知，對于這種盆腔根治術(shù)后神經(jīng)源性膀胱，臨床上多數(shù)病人需行間歇導(dǎo)尿或接受恥骨上膀胱造瘺［11］，不僅容易造成反復(fù)感染，且生活質(zhì)量嚴(yán)重低下。而近年來，越來越多的研究表明利用干細(xì)胞移植治療可對脊髓損傷或糖尿病等原因所致神經(jīng)源性膀胱有較明顯的改善［12-13］。這是由于干細(xì)胞一方面在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞；另一方面干細(xì)胞可通過分泌多種促進(jìn)神經(jīng)生長修復(fù)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)的再生修復(fù)［14］。因此后續(xù)可以通過干細(xì)胞移植治療觀察是否能夠改善排尿功能，而具體選擇何種干細(xì)胞和移植途徑需要更深入的研究。

本研究證明通過損傷大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)以建立神經(jīng)源性膀胱模型的方法是有效、簡便且可重復(fù)的，為盆腔根治術(shù)后神經(jīng)源性膀胱的研究提供了理論和實驗依據(jù)。