HPLC法測定蒙藥梔子-3湯中梔子苷含量

張躍祥，張智慧，王玉華*，王 偉

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

梔子-3湯是由梔子、蘇木、紅花三味藥材等比例組成的蒙藥制劑。本品具有清血熱，活血通經(jīng)的功效，臨床上主要用于小腹脹痛、月經(jīng)不通等癥。梔子是方中君藥，文獻[1-2]研究顯示，梔子具有瀉火除煩、清熱利濕、消腫止痛的功效，用于治療熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄和扭挫傷痛等。主要成分是環(huán)烯醚萜、黃酮、三萜、有機酸和揮發(fā)油等成分，環(huán)烯醚萜類成分梔子苷是梔子的主要指標成分。目前,梔子-3湯無含量控制標準，因此本文采用高效液相色譜法[3]建立了梔子-3湯中梔子苷的含量測定方法，該法的建立為梔子-3湯質(zhì)量標準的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津SCL-10AVP型高效液相色譜儀(島津儀器有限公司，日本)；SBL-20DT型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司，寧波)；Mettler-Toledo XPR10型萬分之一電子天平和Mettler-Toledo MS105DU型百萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，江蘇)。

1.2 試藥

梔子苷對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號110749-201919，純度97.1%)；梔子-3湯樣品(錫林郭勒市鑲黃旗蒙醫(yī)院提供，批號201809006、201809012、201809013)；自制樣品(批號201908018)；流動相所用乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈-水(15∶85)為流動相；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進樣量為10μL；檢測波長238nm；理論板數(shù)按梔子苷峰計算理論板數(shù)應(yīng)不低于1500。

2.2 制備對照品溶液

取梔子苷對照品加入甲醇使溶解并制成每1ml含30μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 制備供試品溶液

取本品約0.1g，精密稱定，置錐形瓶中，準確加入甲醇25ml，密塞，稱定溶液和瓶子的總重，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)20分鐘，放到室溫，再稱定重量，用甲醇補足因超聲提取過程中減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 制備陰性對照溶液

按本品處方配制不含梔子藥材的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。見圖1。

圖1的結(jié)果顯示，供試品圖譜和對照品圖譜在相同的保留時間處有對應(yīng)的梔子苷的色譜峰，且色譜峰的對稱性好；陰性對照圖譜中在此保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他共存成分無干擾，方法專屬性好。

2.6 線性關(guān)系

精密吸取對照品溶液1、3、5、7、10、15、20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積積分值(Y)對梔子苷的進樣量(X：μg)進行回歸分析。結(jié)果顯示，在0.027～0.541μg 范圍內(nèi)梔子苷與積分值呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=638.5896X-143.6079(r=0.9999)。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液于制備后0、1、2、3、4、5、6、7h進樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在所考察的不同時間點范圍內(nèi)所測得峰面積積分值基本不變，RSD為1.51%。供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定，能夠滿足測定所需要的時間。

2.8 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。6次測定峰面積積分值的RSD為0.92%，表明該液相色譜儀精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取批號201809006供試品6份，每份約0.1g，制備供試品溶液，測定梔子苷含量。結(jié)果顯示，樣品中梔子苷平均含量為11.34mg/g，RSD為1.07%，方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗

取已知含量供試品(批號201809006，梔子苷含量為11.34mg/g)9份，每份約10mg，精密稱定，分別加入一定量的梔子苷對照品溶液，制備加樣供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，計算加樣回收率。梔子苷的平均回收率為102.24%，RSD為1.50%，表明方法準確度好，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

3 樣品測定

取三批樣品(批號201809006、201809012、201809013)及自制樣品(批號201908018)各兩份，每份約0.1g，制備供試品溶液，進樣10μL，記錄色譜圖。計算，即得結(jié)果。測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

結(jié)果顯示，三批樣品及自制樣中梔子苷的含量有所差異，可能是因梔子藥材的來源不同及制備過程的損失量不同造成，因此需控制樣品中梔子苷的含量以達到保證質(zhì)量的目的。

4 討論

4.1 測定指標的選擇

梔子是梔子-3湯的君藥，梔子苷則是梔子主要活性成分之一，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、解熱、利膽和輕瀉等多種藥理作用[4-6]，故本試驗選擇梔子苷進行含量測定。

4.2 色譜條件的選擇

本試驗在確定色譜條件時，應(yīng)用《中國藥典》2015年版“梔子”項下測定方法，并對柱溫為25℃、30℃、35℃的條件進行了考察[7-8]。結(jié)果顯示，在柱溫30℃，流動相為乙腈-水(15∶85)條件下測定，梔子苷峰分離度及對稱性良好，出峰時間適中。

4.3 超聲提取時間的選擇

在保證樣品粉碎粒度、提取溶劑一致的情況下，分別考察超聲提取10min、20min、30min后，梔子-3湯中梔子苷的含量。結(jié)果顯示，超聲提取20min后，梔子苷含量不再增加，故選擇超聲20min可以保證提取完全。