高剪切法提取香蕉皮總多酚的工藝優(yōu)化

張苗，張潔，代斌

(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003)

香蕉(MusananaLour.)是芭蕉科芭蕉屬植物，其果實營養(yǎng)豐富，且活性價值高，果皮也被廣泛用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療口腔炎癥和促進腸蠕動[1]。香蕉皮占全果重量的30%～40%左右[2]，因其中含有大量的維生素和礦物質(zhì)，已被作為化妝品的生產(chǎn)原料；此外，香蕉皮還含有豐富的植物多酚類化學(xué)物質(zhì)[3]，具有獨特的抗衰、抗氧化、修復(fù)氧化細胞以及保護細胞不被損傷的功效[4]。植物多酚可通過抗氧化而防止肝臟病變[5]，存在于茶和石榴中的多酚已被證明可以保護肝臟免受酒精相關(guān)的損害[6]。

目前，國內(nèi)外對香蕉皮多酚的提取已有一些研究[7-9]，但存在提取成本高、耗能、時間長效率低、難以實現(xiàn)工業(yè)化等各種缺陷。近幾年發(fā)展的高剪切法是可以輔助溶劑提取的新技術(shù)，其極高的剪切速度和高頻的機械效應(yīng)可以強化溶解、分散、混合、萃取等過程，提取中可使細胞壁快速破損，有效組分在極性相似的溶劑作用下很快溶出，從而高效獲得香蕉皮中的有效組分。高剪切具有普通提取方法無法達到的提取效果，尤其適用于天然物質(zhì)的植物活性成分，同時，高剪切具有操作簡單、耗能低、原料使用量少和組分提取時間較短的優(yōu)點，比溶劑連續(xù)提取、微波、超聲等方法的效率大幅提高[10-14]。研究[15-17]表明，高剪切法不僅可以提高有效組分的得率、節(jié)省提取時間，還能保持活性組分的生物活性。

由上述研究可知高剪切是一種簡單、快速、綠色、高效的天然產(chǎn)物提取方法，因此，利用高剪切提取的諸多優(yōu)勢，本文實驗通過高剪切輔助乙醇溶劑提取香蕉皮中的總多酚，首先采用單因素實驗考察料液比、乙醇溶劑的濃度、高剪切實驗設(shè)備的參數(shù)等對香蕉皮凍果中總多酚提取得率的影響，確定較優(yōu)參數(shù)范圍，然后借助響應(yīng)面法(RSM)[18-19]對實驗工藝進行分析和優(yōu)化，以期得到香蕉皮凍果中總多酚提取的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 原料

購買顏色亮麗、無破損、無氧化的新鮮香蕉，取香蕉皮，熱燙鈍化多酚氧化酶[20]，40 ℃烘至香蕉皮質(zhì)量不再改變，剪碎成小粒，冷凍保存。

1.2 儀器與試劑

采用儀器如下：FA25型弗魯克間歇式高剪切分散乳化機(上海Fluko科技發(fā)展有限公司)、AL04萬分之一精密天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、Bioridge RG-160AT離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)、OSB-2200恒溫反應(yīng)槽(東京理化器械株式會社)、Cintra 20紫外-可見分光光度計(澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司)。

采用試劑如下：沒食子酸標準品(Alfa-Esa(中國)化學(xué)有限公司)、福林-酚(Folin-Ciocalteu)試劑(TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、無水乙醇等其余分析純試劑(上海Admas-Beta試劑有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 香蕉皮多酚的提取

稱取適量解凍的香蕉皮放置于廣口剪切瓶中，緩慢加入乙醇溶液140 mL，將上述溶液高剪切一定時間后靜置，待其雜質(zhì)沉淀后，取上層清液置于離心機中10 000 r/min離心3 min后得到樣品。

1.3.2 香蕉皮多酚含量的檢測

(1)溶液的配制。精確稱量沒食子酸標準品50 mg，將其置于500 mL容量瓶中后加入適量蒸餾水溶解，振搖混勻后定容至刻度，配制為100 μg/mL沒食子酸標準溶液備用；再稱取干燥的無水碳酸鈉固體50 g，加去離子水適量，定容至500 mL容量瓶，配制為10%的碳酸鈉溶液，備用。

(2)福林-酚法測定條件的確定。精確量取沒食子酸標準溶液0.1 mL，稀釋100倍，分別考察Folin-Ciocalteu用量、碳酸鈉與Folin-Ciocalteu用量比、最大吸收波長、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，由此確定適合香蕉皮多酚的檢測條件，其中測量液體∶Folin-Ciocalteu∶10%碳酸鈉溶液體積比為1∶4 ∶16，測定條件為40 ℃恒溫，反應(yīng)時間30 min，測量波長760 nm。

(3)標準曲線的繪制。分別向10 mL比色管中移取體積為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的標準沒食子酸溶液，依次加入Folin-Ciocalteu試劑0.4 mL、10%碳酸鈉溶液1.6 mL后定容，于40 ℃的恒溫槽中遮光反應(yīng)30 min，取出放至室溫，于760 nm測定吸光度值，以均值繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示，標準曲線的方程如下：

y=0.123 1x+0.003 7，R2=0.999 7。

圖1 沒食子酸溶液標準曲線

(4)測定多酚含量。移取0.1 mL香蕉皮多酚提取物，以確定的Folin-Ciocalteu法檢測條件，測量吸光度，香蕉皮凍果中總多酚的得率由標準曲線方程計算得到，多酚得率的計算公式如下：

(1)

式(1)中，M為總多酚的得率(mg/g，GAE/Fw)，以標準沒食子酸計算，y是樣品提取物的吸光度值；V為溶劑體積(mL)，m為香蕉凍果皮的質(zhì)量(g)。

1.3.3 高剪切提取單因素試驗

采用高剪切輔助乙醇法提取香蕉皮多酚，通過試驗考察4個單因素對香蕉皮多酚得率的影響，4個因素分別為液料比、乙醇體積分數(shù)、剪切轉(zhuǎn)速和剪切時間。不同因素設(shè)定不同水平，通過試驗確定不同因素的較優(yōu)范圍。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

為了優(yōu)化多酚的提取條件，以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，以香蕉皮總多酚的提取含量為指標和響應(yīng)值，采用以上4個因素設(shè)計四因素三水平的試驗方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比的影響

分別稱取解凍后的香蕉皮28、14、7、4.67、3.5 g于剪切瓶中，加入140 mL乙醇溶液(40%)，分別對應(yīng)液料比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，以13 000 r/min的剪切轉(zhuǎn)速，高速剪切3 min后靜置，待分層澄清后取上層清液，于離心機中以10 000 r/min的速度離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法最優(yōu)反應(yīng)及測試條件測定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計算得到，液料比的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比的影響

由圖2可以看出：物料多對香蕉皮多酚的提取不利。其原因是，由于物料量越大，溶劑粘度也隨之大，物料得不到充分的剪切，同時還會發(fā)生空轉(zhuǎn)現(xiàn)象，不斷增大實驗的溶劑量會造成植物總多酚產(chǎn)量增多。液料比為20∶1時，香蕉皮凍果中總多酚的得率為5.43 mg/g，達到峰值，當(dāng)繼續(xù)增大溶劑量時，植物總多酚的得率開始減小。由此可知，最佳液料比為20∶1。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)的影響

稱取6份解凍的香蕉皮，每份7 g，加入剪切瓶中，固定液料比20∶1，分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液140 mL，以剪切轉(zhuǎn)速13 000 r/min高速剪切3 min后靜置，待固液分層澄清后取上層清液，于離心機中以10 000 r/min離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測試條件測定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計算得到，乙醇體積分數(shù)的影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：香蕉皮凍果中提取出的多酚與乙醇溶劑的體積分數(shù)有關(guān)，乙醇體積分數(shù)為40%時，香蕉皮中提取出的多酚達到最大值5.48 mg/g，增加或者降低這一乙醇濃度時香蕉皮多酚的得率都明顯下降。香蕉皮中多酚類物質(zhì)的極性更接近于40%的乙醇極性，因此在該濃度下多酚能夠大量溶出，所以乙醇濃度選擇40%。

圖3 乙醇體積分數(shù)的影響

2.1.3 高剪切轉(zhuǎn)速的影響

分別稱取解凍的香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，根據(jù)高剪切分散乳化機的5個標準設(shè)定速度為10 000、13 000、16 000、19 000、22 000 r/min，高速剪切3 min后靜置，待固液分層澄清后取上層清液，于離心機中以10 000 r/min速度離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測試條件測定提取液的吸光度值，多酚得率由式(1)計算得到，結(jié)果如圖4所示。

圖4 高剪切轉(zhuǎn)速的影響

由圖4可知：高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min時，總多酚提取量最多，達到5.68 mg/g；起初隨著剪切轉(zhuǎn)速的增加，香蕉皮凍果中提取的總多酚含量明顯提高，在達到最大值后隨著剪切速度的遞增，凍果中總多酚得率顯著降低，這可能是因為剪切力的增強，使得溶液溫度升高加速多酚類物質(zhì)氧化。因此剪切轉(zhuǎn)速設(shè)為16 000 r/min。

2.1.4 剪切時間的影響

分別稱取解凍后香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，剪切轉(zhuǎn)速設(shè)為16 000 r/min，分別剪切1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 min，均質(zhì)化完成后，使溶液靜置，離心后得到總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測試條件測定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計算得到，結(jié)果見圖5。

圖5 剪切時間的影響

圖5顯示：隨著剪切時間的增加香蕉皮凍果中總多酚提取量隨之增加，不間斷剪切3 min時總多酚的得率達到最大值5.70 mg/g，延長剪切時間總多酚提取量降低。一方面高速剪切的時間越長，對植物細胞的破壞力強度越大，另一方面可能是與氧氣接觸的時間越多，酚類被氧化的幾率也越大，從而使多酚質(zhì)量分數(shù)降低，因此將剪切時間選定為3 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計測試和結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面法因素水平的選擇

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)香蕉皮凍果中總多酚的提取量設(shè)計四因素三水平試驗方案，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計

2.2.2 響應(yīng)面法試驗方案及結(jié)果

以高剪切時長(X1)、剪切轉(zhuǎn)速(X2)、液料比(X3)和乙醇體積分數(shù)(X4)為自變量，得率(Y)為響應(yīng)值，通過中心組合試驗測量30個測試點，構(gòu)建響應(yīng)面模型，如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面方差分析

通過軟件分析和方差分析的結(jié)果(表3)可知：P<0.000 1，選用的模型為極顯著；失擬項P>0.05不顯著，表明回歸模型具有較好的擬合性；獲得的測試值接近預(yù)測值，各因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系差異系數(shù)R2為 0.981 8，調(diào)整系數(shù)R2為0.963 6，說明此模型能夠用來描述香蕉皮多酚提取實驗的結(jié)果；信噪比為20.853 > 4,說明該模型響應(yīng)信號較強，變異系數(shù)為1.38%，表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。

在上述實驗中，X1、X12、X22、X32這4個因素極為顯著，X2、X3、X1X2這3個因素較為顯著。

表3 方差分析

2.2.4 響應(yīng)面與等高線

從響應(yīng)面3D圖以及等高線的形狀可直接找出影響實驗值的最直接原因，而且可以直觀描述試驗中不同影響因素的強弱效果，并由響應(yīng)面最大值和等高線則能夠判斷出植物多酚提取需要的最優(yōu)工藝。

受不同變量影響及各因素之間相互作用的響應(yīng)面與等高線見圖6。通過響應(yīng)面分析結(jié)果(圖6)可知：各種因素對香蕉皮中總多酚得率的影響由大至小依次為高剪切時長(X1)、高剪切轉(zhuǎn)速(X2)、料液比(X3)、乙醇體積分數(shù)(X4)；經(jīng)優(yōu)化后的最優(yōu)條件是高剪切時長2.93 min、高剪切轉(zhuǎn)速16 421.50 r/min、液料比21.17∶1(mL/g)和乙醇體積分數(shù)39.27%，預(yù)測總多酚提取得率為5.81 mg/g。

為了便于實際操作，最優(yōu)工藝參數(shù)修正為：高剪切時長3 min，高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min，液料比20∶1(mL/g)，乙醇體積分數(shù)40%，以此條件經(jīng)過3次平行試驗進行方法驗證，香蕉皮凍果中總多酚得率的平均值為(5.74±0.2)mg/g，接近響應(yīng)面分析的預(yù)測值，表明該模型準確、可靠，能較好的優(yōu)化本實驗工藝。

圖6 響應(yīng)面與等高線

3 結(jié)論

(1)本文研究利用高剪切法輔助乙醇提取香蕉皮凍果中總多酚，經(jīng)單因素實驗及響應(yīng)面法進行優(yōu)化后獲得的最優(yōu)提取方法如下：液料比20∶1 mL/g，乙醇體積分數(shù)40%，高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min，高剪切時長3 min，香蕉皮凍果中總多酚得率的平均值為(5.74±0.2)mg/g。

(2)由高剪切輔助乙醇提取香蕉皮中總多酚耗時短，提取得率高、設(shè)備簡單，能耗低，是適合于天然多酚提取的方法。