泛素連接酶E6AP敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建與鑒定

彭康莉，趙博

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

人乳頭瘤病毒E6相關(guān)蛋白(E6-associated protein，E6AP)是一種泛素E3連接酶，由基因UBE3A編碼，可參與細胞中底物的泛素化[1-2]。UBE3A基因位于人類染色體15q11.2-q13.3，在神經(jīng)元中，母親遺傳的UBE3A基因拷貝具有功能，來自父親的基因拷貝則處于失活或者沉默狀態(tài)，此現(xiàn)象被稱為基因組印記[3]。UBE3A基因拷貝數(shù)變異會導(dǎo)致E6AP過表達，引發(fā)孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorders,ASDs)[4]，其特征表現(xiàn)為交流能力受損，重復(fù)行為增多；UBE3A基因缺失或突變則會引發(fā)天使綜合征(Angelman syndrome，AS)[3]，伴隨嚴重精神發(fā)育遲緩、言語障礙、癲癇發(fā)作等癥狀。由此可見，UBE3A基因表達量的調(diào)控對于神經(jīng)發(fā)育具有重要的作用。

在真核細胞中，在泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzyme，E3)的級聯(lián)作用下，泛素傳遞至底物對其進行泛素化修飾[5]。泛素化作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾可介導(dǎo)底物蛋白經(jīng)蛋白酶體降解的過程，同時也參與了細胞周期、DNA代謝、信號傳導(dǎo)等細胞生理過程的調(diào)控[6]。在泛素化修飾中，泛素連接酶E3決定了底物識別的特異性，然而如何找到并鑒定細胞中600多種E3對應(yīng)的下游底物是目前底物泛素化研究的難點。E3與底物的復(fù)雜交叉反應(yīng)使得難以通過RNA干擾等技術(shù)來找到特定E3對應(yīng)的底物。

E6AP是一種HECT(homologous to the E6AP carboxyl terminus)E3，泛素先傳遞至HECT E3上，再通過HECT E3傳遞至底物[7]。E6AP最初被鑒定為100 kDa的蛋白，在人乳頭瘤病毒16型(HPV)的 E6癌蛋白的作用下，發(fā)揮E3活性，參與底物p53的泛素化修飾過程[7-8]。E6AP除了與E6作用發(fā)揮泛素連接酶活性外，自身也可作為泛素連接酶泛素化底物。通過酵母雙雜交系統(tǒng)的方法，E6AP的泛素化底物Src家族酪氨酸激酶(B-cell lymphocyte kinase，Blk)[9]、人源化DNA修復(fù)蛋白(DNA repair protein，Rad23)[10]相繼被發(fā)現(xiàn)。

鑒于E6AP在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的重要性，越來越多的研究試圖闡明E6AP的作用機制。Greenberg組報道經(jīng)驗驅(qū)動的神經(jīng)元活動會誘導(dǎo)UBE3A基因轉(zhuǎn)錄，隨后其編碼的E6AP蛋白通過調(diào)控活動調(diào)節(jié)的細胞骨架相關(guān)蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein，Arc)的降解來調(diào)節(jié)興奮性突觸發(fā)育[11]。該組報道E6AP通過蛋白酶體促進Arc的降解，同時也通過質(zhì)譜證實E6AP對Arc的泛素化調(diào)節(jié)。該組通過研究發(fā)現(xiàn)E6AP是一種神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)蛋白，在神經(jīng)元無法正常表達E6AP的情況下，會上調(diào)Arc的表達，神經(jīng)元中積累過多的Arc則會導(dǎo)致突觸中AMPA受體(AMPARs)過度內(nèi)在化以及突觸功能受損。AMPA受體運輸受損可能是導(dǎo)致天使綜合征患者認知功能障礙的病因。

由于突觸功能障礙也是阿爾茲海默癥的主要特征，最近有研究報道在阿爾茲海默癥模型小鼠Tg2576中，E6AP表達量降低，導(dǎo)致Arc積累，從而使得AMPAR亞基GluR1在膜表面表達量降低，最終導(dǎo)致突觸功能改變。而通過恢復(fù)神經(jīng)元中E6AP 的表達則可改善上述現(xiàn)象[12]，由此可見E6AP對Arc的泛素化調(diào)節(jié)可作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新途徑。

通過哺乳動物氨基酸的穩(wěn)定同位素標記法，一種蛋白磷酸酶2 A(protein phosphatase 2 A，PP2A)的激活劑PTPA經(jīng)報道也是E6AP的底物[13]。隨著越來越多的底物被發(fā)現(xiàn)，E6AP對底物的泛素化修飾如何影響底物的下游功能是后續(xù)研究的難點。

本文成功構(gòu)建E6AP敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，以已知底物Arc為陽性對照，發(fā)現(xiàn)E6AP敲減組可降低對Arc的泛素化修飾，與之對應(yīng)的E6AP過表達組則會增強對Arc的泛素化修飾。后續(xù)我們將以構(gòu)建好的兩種細胞模型為基礎(chǔ)，進一步研究一些與疾病相關(guān)的底物的泛素化，并從中發(fā)現(xiàn)細胞中未知的E6AP底物，為底物相關(guān)疾病的治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞HEK-293購自中國科學(xué)院細胞庫；胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶購自Gibico公司；DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；大腸桿菌XL-1 Blue感受態(tài)細胞菌種購自天根生化科技(北京)有限公司；4種靶向E6AP的shRNA慢病毒GIPZ質(zhì)粒購自GE Dharmacon(Lafayette,CO)；pRK-myc-Arc質(zhì)粒由本室保存；pLVX-IRES-mCherry 質(zhì)粒由本室保存；KOD-Plus-Neo Kit、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Gel/PCR純化提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自Favorgen公司；Trizol裂解試劑、Fast Digest限制性內(nèi)切酶、10x Fast Digest Buffer、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer均購自Thermo Fisher公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI 購自Polysciences公司；MG132購自Millipore公司；protein A/G beads、抗體anti-E6AP、anti-myc、anti-Ub、anti-actin均購自Santa Cruz公司；引物合成、質(zhì)粒測序均由金唯智(上海)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的細胞置于37 ℃ 水浴鍋中融化，完全融化的細胞懸液倒入含有新鮮完全培養(yǎng)基的試管中，離心后棄掉上清，用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀后接種至培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)；定期觀察細胞長勢，并適時給細胞換液或傳代。

1.2.2 過表達載體pLVX-E6AP-IRES-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2.1 從HEK-293細胞中提取RNA

以12孔板為例，吸出培養(yǎng)基后，每孔加入500 μL Trizol試劑，置于搖床上5 min；待細胞裂解完全后，轉(zhuǎn)移裂解液至1.5 mL EP管中，每管加入100 μL氯仿，混勻后靜置3 min；離心(4 ℃，13 000 g)15 min，吸取上層液體于新的EP管中，每管加入250 μL異丙醇，混勻后靜置7 min；離心(4 ℃，13 000 g)10 min，小心移去上清液，加入500 μL 75%乙醇懸浮管底白色沉淀；離心(4 ℃，7 500 g)5 min，小心吸去上清液，EP管倒置10 min；待EP管中無液體殘留后，加入適量DEPC水至EP管中溶解RNA。

1.2.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增

根據(jù)RNA濃度計算出1 μg RNA對應(yīng)的RNA體積，加入DEPC水使得總體積為7 μL/管；RNA樣品置于PCR儀中在 65 ℃ 中反應(yīng)5 min，取出后放置于冰上，加入RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中0.5 μL Primer Mix、0.5 μL Enzyme Mix以及2 μL緩沖液于RNA樣品中，使得總體積為10 μL/管；重新置于PCR儀中，37 ℃ 反應(yīng)60 min，95 ℃ 5 min使得酶失活，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至4 ℃ 得到cDNA樣品。

以cDNA為模板，加入E6AP上下游底物，按照KOD酶說明設(shè)置PCR反應(yīng)體系，樣品混勻后置于PCR儀中，按照以下程序進行PCR擴增反應(yīng)：94 ℃ 預(yù)變性2 min，98 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，反應(yīng)35個循環(huán)，最后68 ℃ 延伸7 min，得到的PCR產(chǎn)物可于4 ℃ 保存。

1.2.2.3 pLVX-IRES-mCherry載體酶切及與E6AP目的基因連接

用限制性內(nèi)切酶BamHI、SpeI對pLVX-IRES-mCherry載體及E6AP PCR產(chǎn)物進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收得到載體及目的基因片段，加入T4 DNA連接酶，16 ℃ 連接過夜。

連接產(chǎn)物取2 μL加入至 50 μL XL-1 Blue感受態(tài)細胞中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化后，加入1 mL SOC于37 ℃ 復(fù)蘇1 h。涂布于Amp的LB平板上，平板倒置于37 ℃ 培養(yǎng)箱過夜。次日從平板上挑取4～6個單克隆，提取質(zhì)粒后經(jīng)測序鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293 細胞

待HEK-293細胞融合度達到70%～90% 后，準備2個管，分別加入opti-MEM培養(yǎng)基；再將適量質(zhì)粒加入其中1個管，按照質(zhì)粒質(zhì)量3倍體積量加入PEI轉(zhuǎn)染試劑至另1個管中，室溫靜置5 min后，將兩管混合，室溫孵育20 min；吸出原有細胞培養(yǎng)液，換成opti-MEM培養(yǎng)基，再緩慢滴入質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合液；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，換成完全培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)至48～72 h收細胞做后續(xù)western驗證實驗。若質(zhì)粒上帶有EGFP或mCherry標簽，可通過檢測熒光的強弱來觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 E6AP敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

1.2.4.1 嘌呤霉素殺滅曲線確定最適抗生素濃度

按每孔2～5×104的細胞密度鋪板24孔板，培養(yǎng)24 h后觀察細胞生長狀態(tài)；若密度在30%～50%，可準備篩選培養(yǎng)基—嘌呤霉素濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、3、4、5 μg/mL的新鮮完全培養(yǎng)基，吸去原培養(yǎng)基，加入篩選培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)；2～3 d更換新鮮篩選培養(yǎng)基，連續(xù)觀察4～6 d，能夠殺死細胞的最低篩選濃度即為最適濃度。

1.2.4.2 E6AP 敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選

按每孔1×106的細胞密度鋪板6孔板，觀察細胞長勢；若密度在50%～70%，則可轉(zhuǎn)染購自Dharmacon的4種不同shE6AP質(zhì)粒以及pLVX-E6AP-IRES-mCherry過表達質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化轉(zhuǎn)染后的細胞，用最適濃度嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基懸浮細胞沉淀，按照合適比例稀釋懸液，重新接種至10 cm細胞皿進行培養(yǎng)。

每日觀察細胞狀態(tài)，待出現(xiàn)貼壁細胞后，約2～3 d更換新鮮篩選培養(yǎng)基；維持篩選濃度培養(yǎng)10～14 d，挑取顯微鏡下不同單克隆細胞于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；待24孔板細胞長滿后，轉(zhuǎn)移至6孔板。6孔板細胞長滿后，可收集部分細胞做后續(xù)western實驗驗證篩選是否成功；若E6AP表達明顯降低或增強，則可擴大培養(yǎng)，并及時凍存。

1.2.5 免疫共沉淀驗證E6AP泛素化底物Arc

shE6AP、shE6AP+E6AP、HEK-293、E6AP 過表達四種細胞轉(zhuǎn)染pRK-myc-Arc 48 h后經(jīng)10 μmol/L MG132處理4 h；冰PBS洗2次，加入預(yù)冷的RIPA(含蛋白酶抑制劑)進行裂解；置于4 ℃ 15 min，細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 管，離心(4 ℃，13 000 g)30 min后將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管；對細胞裂解液定量，取總蛋白3 mg，加入6 μg anti-myc抗體于4 ℃ 孵育4 h，再加入30 μL protein A/G beads孵育過夜；次日結(jié)合了beads的細胞裂解液離心(4 ℃，13 000 g)5 min，吸去上清；beads用1 mL PBS洗滌4次，結(jié)束后用30 μL PBS重懸beads，再加入上樣緩沖液，煮沸10 min；取上清上樣，經(jīng)4%～15% SDS-PAGE膠分離后，轉(zhuǎn)膜封閉，膜用anti-Ub抗體孵育過夜。

1.2.6 Western印跡分析及定量

SDS-PAGE電泳結(jié)束后，半干法轉(zhuǎn)膜，可看到蛋白Marker顯示在PVDF膜上，將膜置于5% 脫脂牛奶中室溫封閉1 h；用5% 脫脂牛奶以1∶1 000比例稀釋孵育膜的抗體，置于4 ℃ 搖床上孵育過夜；次日用含0.05% Tween-20及0.05% Triton X-100的TBST緩沖液洗膜，每次10 min，共3次；用一抗對應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠/兔二抗1∶10 000(稀釋)室溫孵育1 h；用TBST緩沖液洗膜3次后，加入顯影液，靜置1 min，去盡殘液，置于X-光片夾中，于暗室壓片顯影。

利用惠普掃描儀采集圖片，用ImageJ軟件對目的蛋白及內(nèi)參蛋白條帶進行灰度分析得到灰度值，將二者的灰度值相除，進行歸一化處理。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-E6AP-IRES-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建

以人胚腎293細胞cDNA為模板進行PCR擴增得到的全長E6AP片段大小符合預(yù)期值(圖1A)。構(gòu)建好的質(zhì)粒通過雙酶切驗證，可看到載體與目的基因條帶分開，條帶大小與預(yù)期一致(圖1B)，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 E6AP PCR片段及E6AP過表達質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 瞬時轉(zhuǎn)染shE6AP質(zhì)粒至HEK-293細胞

將4種shE6AP1、shE6AP2、shE6AP3、shE6AP4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至HEK-293細胞，由于載體上帶有EGFP熒光標簽，于熒光顯微鏡下可觀察到85% 以上的細胞表達綠色熒光蛋白(圖2A、2B)，轉(zhuǎn)染效率較高。

待轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞做western驗證，與對照組相比，4種shE6AP均未明顯降低E6AP表達(圖2C)。

2.3 shE6AP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

由于瞬時轉(zhuǎn)染shE6AP質(zhì)粒未能明顯降低E6AP表達，我們猜測可能是因為E6AP半衰期較長，表達較穩(wěn)定，難以在短時間內(nèi)檢測到表達量的變化。由于載體上帶有嘌呤霉素篩選標記，故而可通過藥物篩選得到能穩(wěn)定降低E6AP表達的細胞株。嘌呤霉素殺滅曲線顯示最適濃度為2 μg/mL，后續(xù)實驗以此濃度篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

由于瞬時轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液western結(jié)果顯示4種shE6AP無明顯差別，故分別以這4種shE6AP篩選4種不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

藥物篩選維持一個月后，通過比較不同組細胞株中E6AP表達情況，可發(fā)現(xiàn)shE6AP2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株對E6AP表達的抑制作用最強(圖2D、2E)，故以此穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行后續(xù)研究。

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 shE6AP 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株表達情況分析

2.4 瞬時轉(zhuǎn)染E6AP過表達質(zhì)粒至HEK-293細胞

將構(gòu)建成功的pLVX-E6AP-IRES-mCherry質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至HEK-293細胞，由于載體上帶有mCherry熒光標簽，于熒光顯微鏡下可觀察到85% 以上的細胞呈現(xiàn)較強紅色熒光(圖3A、3B)，轉(zhuǎn)染效率較高。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞蛋白。

Western結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒組與對照組相比，E6AP的表達量明顯增加(圖3C)。

2.5 E6AP過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示構(gòu)建的E6AP過表達質(zhì)粒能顯著增強E6AP表達，但瞬時轉(zhuǎn)染持續(xù)時間短，目的基因會隨著細胞分裂而逐漸丟失，而穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株則能保證目的基因持續(xù)穩(wěn)定表達，易于研究基因功能。

由于E6AP過表達載體上帶有嘌呤霉素篩選標記，故而可通過嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，直至得到能穩(wěn)定過表達E6AP的細胞株。

藥物篩選維持一個月后，我們挑取6個細胞株通過western實驗比較不同細胞株中E6AP表達情況，結(jié)果顯示3個細胞株與對照組相比均能顯著增強E6AP表達(圖3D、3E)，其余3個細胞株與對照組相比E6AP表達量差別不大，我們猜測可能是由于E6AP過表達基因未能成功整合至細胞自身的基因組上，故而未能增強E6AP表達。將篩選成功的3個細胞株擴大培養(yǎng)后，進行后續(xù)研究。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0,001圖3 E6AP過表達質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株表達情況分析

2.6 E6AP敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株對底物Arc的泛素化影響(圖4)

由于E6AP是一種泛素E3連接酶，在細胞中敲減或者過表達E6AP，其下游底物泛素化可能會發(fā)生相應(yīng)變化。

為驗證猜想，我們以E6AP已知底物Arc為陽性對照，比較shE6AP、shE6AP+E6AP、HEK-293以及E6AP過表達4組細胞對Arc泛素化修飾的區(qū)別。由于HEK-293細胞本底不表達Arc，故轉(zhuǎn)染pRK-myc-Arc至4組細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，4組細胞裂解液經(jīng)anti-myc抗體捕獲后孵育anti-Ub抗體以檢測泛素化修飾水平強弱。

結(jié)果顯示，與HEK-293組相比，shE6AP組泛素化smear條帶最弱(圖4B)，說明shE6AP組可降低對Arc的泛素化修飾。與之對應(yīng)的E6AP過表達組泛素化smear條帶最強(圖4B)，說明E6AP過表達可增強對Arc的泛素化修飾，而shE6AP細胞轉(zhuǎn)染E6AP后，則可恢復(fù)對Arc的泛素化修飾功能(圖4B)，其泛素化smear條帶與HEK-293組相比差別不大。

這些結(jié)果表明E6AP表達量上調(diào)或下調(diào)，會相應(yīng)影響下游底物泛素化。

A—shE6AP、shE6AP+E6AP、HEK-293、E6AP過表達4種細胞裂解液E6AP、actin表達情況；B—4種細胞裂解液經(jīng)anti-myc抗體捕獲后孵育anti-Ub抗體檢測泛素化修飾水平強弱圖4 E6AP敲減及過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株對Arc的泛素化影響

3 討論

盡管UBE3A基因被發(fā)現(xiàn)距今25年，但對其在細胞中行使的生物學(xué)功能以及參與的細胞過程仍知之甚少。據(jù)報道UBE3A基因編碼的E6AP蛋白活性失調(diào)會引發(fā)宮頸癌、天使綜合征、孤獨癥譜系障礙等病癥。宮頸癌主要是由小的雙鏈DNA病毒HPV感染黏膜引起[14]，導(dǎo)致病毒早期基因E6持續(xù)表達癌蛋白E6，E6蛋白與E6AP形成復(fù)合物，發(fā)揮泛素E3連接酶活性，對p53進行多聚泛素化修飾，隨即降解p53，而p53作為一種重要的腫瘤因子經(jīng)泛素化降解失活后則會誘發(fā)癌變[15]。E6AP除了與E6作用發(fā)揮泛素連接酶活性外，自身也可作為泛素連接酶泛素化底物，前述提到的Blk[9]、Rad23[10]、Arc[11]、PP2A[13]均為E6AP非依賴于E6而直接作用的底物。

天使綜合征(Angleman Syndrome，AS)是一種罕見的神經(jīng)發(fā)育障礙病癥，患者有言語障礙、抽搐、癲癇發(fā)作等癥狀[16]，經(jīng)報道AS的病因是UBE3A基因表達受損，由于UBE3A基因在神經(jīng)元中存在基因組印記現(xiàn)象，母本等位基因是UBE3A基因表達E6AP蛋白的唯一來源。在AS小鼠模型中，通過使來自父本的Ube3a基因在神經(jīng)元中維持非沉默狀態(tài)，可部分恢復(fù)小鼠Ube3a基因功能，促進E6AP的表達，改善由AS引發(fā)的認知缺陷[17]。

孤獨癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorders，ASD)是一種異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙，其特征是社交互動受損和重復(fù)性行為[18]。關(guān)于ASD的病因仍存在爭議，但研究表明UBE3A基因復(fù)制或三重復(fù)制會導(dǎo)致E6AP表達增強，同時也伴隨孤獨癥特征水平升高[19]。有研究報道，隨著小鼠核中Ube3a基因表達E6AP增加，小鼠社交能力所需的谷氨酸能突觸形成區(qū)Cerebellin-1(Cbln1)的表達會隨之降低。E6AP可能通過其轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)功能抑制Cbln1的表達，而不是通過泛素化降解機制[20]，這表明E6AP可能是通過非泛素化修飾途徑影響ASD。

在E6AP對相關(guān)疾病的調(diào)控中，目前的研究大多數(shù)都集中于尋找疾病模型中E6AP對應(yīng)的下游靶點，探究E6AP對底物的泛素化修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，為闡明疾病可能的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

雖然通過酵母雙雜交系統(tǒng)等方法，越來越多的E6AP下游底物被發(fā)現(xiàn)，但E6AP對這些底物的泛素化修飾如何影響其功能卻未有很多報道。在研究較多的AS及ASD病癥中，仍未發(fā)現(xiàn)與這些病癥緊密相關(guān)并且可受E6AP調(diào)控的底物。本文從調(diào)控HEK-293細胞中E6AP表達量入手，一方面通過可特異性結(jié)合E6AP mRNA的shRNA抑制E6AP表達，另一方面則通過構(gòu)建E6AP過表達質(zhì)粒增強其表達。為實現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達，本文通過嘌呤霉素篩選得到能穩(wěn)定敲減以及過表達E6AP的細胞株。在此基礎(chǔ)上，以已知底物Arc為陽性對照，本文通過免疫共沉淀實驗驗證在E6AP敲減及過表達的情況下，可相應(yīng)影響HEK-293細胞中Arc的泛素化修飾水平，不僅再次鑒定Arc是E6AP的底物，更是證明本文成功構(gòu)建的兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株可用于E6AP下游底物功能研究。后續(xù)我們將以構(gòu)建好的兩種細胞模型為基礎(chǔ)，進一步研究一些與疾病相關(guān)的底物的泛素化，并從中發(fā)現(xiàn)細胞中未知的E6AP底物，從泛素化降解的角度提供治療底物相關(guān)疾病的新方法，以期闡明E6AP在細胞生命活動中發(fā)揮的作用。