UPLC-Q-TOF／MS 法坤怡寧顆粒化學(xué)成分分析

趙桂鈴繆興龍宋兆輝高 雯周桂榮?李 萍?

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開(kāi)發(fā)中心，天津 300410；3.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410）

坤怡寧顆粒由地黃、黃芪、淫羊藿等7 味藥材組成。該方用來(lái)治療圍絕經(jīng)期綜合征［1］，是臨床經(jīng)驗(yàn)處方，以滋腎養(yǎng)陰、平肝寧心為治療原則。目前針對(duì)坤怡寧顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)坤怡寧顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)115 種化學(xué)成分，并鑒定出109 種，主要包括酚類、黃酮類、單萜苷類等，以期為坤怡寧顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜（Waters ACQUITY UPLC，包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、Empower 2 工作站）、Masslynx 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；Waters Q-TOF Premier 質(zhì)譜儀（英國(guó)Waters MS Technologies 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；粉碎機(jī)（德國(guó)IKA 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-500DV 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒(méi)食子酸（1110831-201204）、芒柄花素（111703-201504）、綠原酸（110753-201415）、梓醇（110808-201009）、兒茶素（110877-2011203）、毛蕊花糖苷（111530-201007）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（111920-201304）、黃芪甲苷（110781-201616）、檸檬酸（111679-200401）、淫羊藿苷（110737-201516）、金絲桃苷（111521-201507）、異槲皮苷（111809-201403）、芍藥苷（110736-201539）、仙茅苷（110771-201506）、寶藿苷Ⅰ（111852-201102）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；朝藿定B（AM775E）、朝藿定C（AM776E）、箭藿苷B（AW412S）、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷Ⅲ對(duì)照品購(gòu)自天津一方科技有限公司；隱綠原酸（20140811）對(duì)照品購(gòu)自天津士蘭科技有限公司；毛蕊異黃酮（DST171108-012）、寶藿苷VII（DST180508-084）、黃芪皂苷Ⅰ（DST170516-016）、異黃芪皂苷Ⅰ（DST180315-022）、朝藿定A1（DST180109-064）對(duì)照品購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；黃芪異黃烷苷（16043004）對(duì)照品購(gòu)自成都普瑞法科技有限公司；各單味藥材及坤怡寧顆粒由天士力研究院提供。甲酸、乙腈（質(zhì)譜純）及甲醇（色譜純）（德國(guó)Merck 公司）；純凈水（吉林娃哈哈食品有限公司）；超純水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.0 min，97% A；1.0～8.0 min，97%～90% A；8.0～9.0 min，90% A；9.0～12.0 min，90%～87% A；12.0～15.0 min，87%～85% A；15.0～25.0 min，85%～76% A；25.0～31.0 min，76%～69% A；31.0～32.0 min，69%～65% A；32.0～34.0 min，65%～60% A；34.0～36.0 min，60%～50% A；36.0～38.0 min，50% A～0；38.0～40.0 min，0～97% A）；體積流量0.3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），MSE掃描正負(fù)離子模式檢測(cè)，掃描范圍m／z50～1 200，亮氨酸腦啡肽為校正液，進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。毛細(xì)管電壓負(fù)離子模式2.3 kV，正離子模式2.8 kV；錐孔電壓40 V；霧化氣為高純度氮?dú)?，體積流量50 L／h；碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣體積流量800 L／h，溫度350 ℃；離子源溫度120 ℃。高能量掃描時(shí)，離子阱為20～60 eV。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定各對(duì)照品適量于量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，甲醇定容至刻度，即得。

2.3 供試品溶液制備 取坤怡寧顆粒及各單味藥材粉末0.5 g，精密移取25 mL 50% 甲醇于錐形瓶中，超聲提取15 min，50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，14 100 r／min 離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果與分析

采用UPLC-Q-TOF-MS 對(duì)供試品及對(duì)照品溶液進(jìn)行正、負(fù)離子全掃描，獲得BPI 圖，共標(biāo)定了115 個(gè)色譜峰，見(jiàn)圖1～2。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)、數(shù)據(jù)庫(kù)匹配分析及查閱文獻(xiàn)，從中發(fā)現(xiàn)115 個(gè)化合物，鑒定了109 個(gè)，包括13 個(gè)酚類、6 個(gè)木脂素類、43 個(gè)黃酮類、7 個(gè)三萜皂苷類、25 個(gè)單萜苷類、11 個(gè)苯丙素類、4 個(gè)其他類，見(jiàn)表1。

圖1 坤怡寧顆粒UPLC-TOF-MS 正離子模式下BPI 圖

圖2 坤怡寧顆粒UPLC-TOF-MS 負(fù)離子模式下BPI 圖

3.1 酚類 在復(fù)方中共檢測(cè)到13 個(gè)酚類化合物，在正離子模式下響應(yīng)較好。峰61 的一級(jí)正離子給出m／z489.137 2 ［M+Na］+的準(zhǔn)離子峰，二級(jí)質(zhì)譜以母離子失去葡萄糖殘基（162 Da）產(chǎn)生m／z327.067 3 的碎片離子，該碎片離子再斷鍵，得到m／z205.046 9 ［M+Na-Glc-C7H6O2］+和m／z123.055 1 ［C7H7O2］+的碎片離子。經(jīng)與對(duì)照品、文獻(xiàn)［7］比對(duì)，鑒定61 號(hào)峰為仙茅苷，見(jiàn)圖3。

圖3 仙茅苷正離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.2 木脂素類 從坤怡寧顆粒中共鑒定出6 種木脂素類成分，其母核結(jié)構(gòu)有雙四氫呋喃型木脂素、苯代四氫萘型等，峰45 的一級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。準(zhǔn)分子離子峰m／z897.300 1［M+Na］+，其二級(jí)碎片離子有m／z765.258 0 ［M+Na-Api］+，m／z735.243 2 ［M+Na-Glc］+，m／z603.205 1 ［M+Na-Api-Glc］+，m／z441.156 4 ［M+Na-Api-2Glc］+和m／z317.091 1 ［Glc+Api+Na］+，通過(guò)文獻(xiàn)［14］，推斷45 號(hào)峰為（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-芹糖-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖基-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表1 坤怡寧顆?；瘜W(xué)成分歸屬

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖4 （-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-芹糖-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖基-4＇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷正離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.3 黃酮類 黃酮類化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較高，在復(fù)方中共檢測(cè)到43 個(gè)，其苷元類型主要為黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮類等。黃酮苷類在ESI-MS 軟電離條件下，可以獲得非常強(qiáng)的分子離子峰，在二級(jí)質(zhì)譜中，易失去糖基形成苷元離子。在負(fù)離子模式下，峰84 給出明顯的分子離子m／z721.236 5 ［M+COOH］-，二級(jí)質(zhì)譜以母離子失去葡萄糖殘基（162 Da）產(chǎn)生m／z513.178 1 的碎片離子；母離子失去鼠李糖殘基（146 Da）產(chǎn)生m／z529.170 6 的碎片離子；m／z409.125 9 是母離子失去3 位鼠李糖后，葡萄糖部分環(huán)裂（-C4H8O4）生成的；母離子在失去葡萄糖殘基的基礎(chǔ)上再脫去鼠李糖殘基（146 Da）產(chǎn)生m／z367.118 6的碎片離子，裂解途徑見(jiàn)圖5。此裂解規(guī)律與文獻(xiàn)［10］一致，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，鑒定為淫羊藿苷。

圖5 淫羊藿苷負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.4 單萜類 共鑒定25 個(gè)單萜類化合物，主要分為單環(huán)單萜類、雙環(huán)單萜類及環(huán)烯醚萜類。該類成分主要來(lái)自赤芍、地黃兩味藥材。

3.4.1 雙環(huán)單萜類 已鑒定14 個(gè)雙環(huán)單萜苷類化合物，包括氧化芍藥苷及其異構(gòu)體、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷及其異構(gòu)體等，該類成分來(lái)自赤芍。高能碰撞易失去苯甲酸（BA）而形成［M-H-122］-和m／z121 ［BA-H］-的特征離子，還易形 成 ［M-HCH2O］-、［M-H-Glu-BA］-等特征離子。38 號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖中給出了明顯的分子離子峰m／z525.160 9 ［M+COOH］-和m／z479.155 0 ［M-H］-，二級(jí)碎片信息有m／z449.144 6［M-H-CH2O］-、m／z357.121 0 ［M-H-BA］-、m／z327.107 9［M-H-CH2O-BA］-、m／z165.053 0 ［M-H-CH2O-BA-Glc］-和m／z121.028 7 ［BA-H］-，經(jīng)與對(duì)照品、文獻(xiàn)［3］比對(duì)，確定峰38 為芍藥苷，見(jiàn)圖6。

圖6 芍藥苷負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.4.2 環(huán)烯醚萜類 環(huán)烯醚萜類化合物的基本母核是環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚及半縮醛羥基，半縮醛羥基性質(zhì)活潑，故該類化合物多以苷類存在［24］。本實(shí)驗(yàn)中環(huán)烯醚萜苷類成分在正離子模式下響應(yīng)值較高，共鑒定8 個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中7 個(gè)來(lái)源于地黃。其中，峰2 一級(jí)質(zhì)譜有m／z385.110 8 ［M+Na］+的準(zhǔn)離子峰，二級(jí)碎片離子有m／z355.085 6 ［M+Na-CH2OH］+、m／z223.056 9 ［M+Na-Glc］+、m／z203.053 9 ［Glc+Na］+和m／z185.016 1 ［Glc+Na-H2O］+。經(jīng)與對(duì)照品、文獻(xiàn)［2］比對(duì)，確定峰2 為梓醇，見(jiàn)圖7。

圖7 梓醇正離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.5 三萜皂苷類 已鑒定三萜類化合物共7 個(gè)，正負(fù)離子均有響應(yīng)，該類化合物易連續(xù)脫糖，包括黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及其異構(gòu)體，來(lái)自黃芪。峰100 給出明顯的分子離子峰m／z829.457 ［M+COOH］-和m／z 793.451 5［M-H］-，二級(jí)碎片離子m／z489.357 3 ［M-H-Glc-Xyl］-為脫去1 分子葡萄糖基（m／z 162）和木糖基（m／z132）產(chǎn)生的。其中發(fā)現(xiàn)峰99 與峰100 為同分異構(gòu)體，分子量相同，經(jīng)與黃芪甲苷對(duì)照品、文獻(xiàn)［15］比對(duì)，確定峰99 為黃芪甲苷，故峰100 為黃芪皂苷Ⅲ，見(jiàn)圖8。

圖8 黃芪皂苷Ⅲ負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

3.6 苯丙素類 從復(fù)方中鑒定了11 個(gè)苯丙素類化合物，其中包括綠原酸、新綠原酸與隱綠原酸3 個(gè)同分異構(gòu)體，母離子為m／z353.085 7 ［M-H］-，二級(jí)碎片離子m／z191.053 9 為母離子丟失一分子咖啡?；跰-H-caffeoyl］-產(chǎn)生的，m／z179.033 0 為脫去糖得到的咖啡?；槠踓affeoyl-H］-，在此基礎(chǔ)上脫去一分子CO2得到m／z135.047 0 ［caffeoyl-H-CO2］-。新綠原酸、隱綠原酸的裂解規(guī)律與綠原酸相似。由于三者質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同，無(wú)法通過(guò)質(zhì)譜分辨，只能通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)［6，12］數(shù)據(jù)來(lái)確定化合物，因此，峰25 經(jīng)對(duì)照品比對(duì)為綠原酸，見(jiàn)圖9；峰28 經(jīng)對(duì)照品比對(duì)為隱綠原酸，故確定峰15 為新綠原酸。

3.7 其他類化合物 其他類化合物包括生物堿類、有機(jī)酸類等。38 號(hào)峰的一級(jí)正離子給出m／z342.172 3 ［M+H］+峰，其二級(jí)碎片離子有m／z297.113 2 ［M-（CH3）2NH］+和m／z265.086 9 ［M-（CH3）2NH-CH3OH］+，且此峰來(lái)自淫羊藿藥材，與文獻(xiàn)［12］一致，推測(cè)32 號(hào)峰為木蘭堿。

4 討論

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，收集坤怡寧顆粒各味藥材的化學(xué)成分，建立化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配分析、化合物精確分子量、碎片離子峰、色譜保留時(shí)間以及對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來(lái)鑒定化學(xué)成分。但由于對(duì)照品的稀缺，一些同分異構(gòu)體物質(zhì)（如峰42、44 等），還需通過(guò)核磁等方法進(jìn)一步研究來(lái)佐證。

圖9 綠原酸負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)坤怡寧顆粒中的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，發(fā)現(xiàn)了115 種化學(xué)成分，包含酚類、黃酮類、單萜苷類等。其所含的主要成分與文獻(xiàn)［25-30］治療圍絕經(jīng)期綜合征的藥理活性成分具有一致性，其中酚類、木脂素類、黃酮類及三萜皂苷類都有植物雌激素樣作用；而單萜苷類具有一定的神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗衰老及增強(qiáng)免疫作用。本研究對(duì)坤怡寧顆粒進(jìn)行全面的化學(xué)成分分析，以期為其質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。