基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討莪術(shù)抗血栓作用機制

周曙光，韋 潔，廖 欣，龐力峰，楊希霖

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022）

莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖，性辛、溫，味苦，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣破血、消積止痛的功效，臨床上多用于治療血滯經(jīng)閉腹痛。近幾年，多項藥理研究指出莪術(shù)活性成分具有抗炎、抗腫瘤等作用［1-3］；課題組前期發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)不同溶劑提取部位均具有抗血栓作用［4-5］，但具體機制仍未知，本研究將從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度探究其抗血栓的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 莪術(shù)化學成分篩選 本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學平臺（TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）檢索莪術(shù)的所有化學成分，共搜集了81 個化合物。鑒于莪術(shù)油活性成分具有明確的抗血栓作用［6］，為充分考慮莪術(shù)藥物特性和優(yōu)勢，避免藥效成分信息遺漏，本研究設(shè)置口服生物利用度（OB≥25%）和類藥性（DL≥0.06）為篩選閾值，獲得34 個化合物作為莪術(shù)活性成分。

1.2 莪術(shù)活性成分候選靶點篩選 利用TCMSP 和BATMANTCM 平臺，對34 個化合物的潛在靶標進行預測，其中TCMSP平臺優(yōu)選Drug Bank 已驗證靶點，BATMAN-TCM 平臺優(yōu)選Score≥40 的靶點，采用藥物相似性比對原理，將所收集靶點匯總?cè)ト哂啵礊樗幬镱A測靶點。

1.3 血栓疾病基因收集 利用 DrugBank、OMIM、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫獲取血栓相關(guān)的疾病基因，將所收集基因靶點去冗余，即為血栓靶點。

1.4 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將莪術(shù)活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)文件導入Cytoscape3.5.1 軟件，通過Network Analyzer 工具分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點，獲取對應拓撲度值（degree），以≥2 倍degree 的中位數(shù)為篩選條件，獲取莪術(shù)活性成分作用的潛在關(guān)鍵靶點。

1.5 藥物活性成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 獲得莪術(shù)成分對應靶點和疾病靶點信息后，利用String軟件構(gòu)建藥物靶點-疾病的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），再利用Cytoscape3.5.1 軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，提取網(wǎng)絡(luò)中的交集部分，即為莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點。

1.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫工具和Cytoscape ClueGo 插件分別對上述關(guān)鍵靶點／基因進行KEGG 通路富集分析和GO 分析，獲得莪術(shù)治療血栓相關(guān)疾病的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)的活性化學成分 通過OB≥25%和DL≥0.06 篩選獲得34 個化合物，見表1。

2.2 莪術(shù)活性化學成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫（Drug Bank 已驗證靶點）和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（Score≥40）中，獲取上述34 個化合物的預測靶點。其中有5 個成分，姜黃酮、Wenjine、三環(huán)萜、（4S，5S）-（+）-吉馬酮4，5-環(huán)氧化物、雙去甲氧基姜黃素，無符合篩選條件的對應靶點，故舍棄。利用Cytoscape 3.5.1 構(gòu)建莪術(shù)活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖1 所示，莪術(shù)29 個主要活性成分的靶點（去冗余）共計81 個。在該成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中，靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的degree 中位數(shù)為3，選取degree≥6 的節(jié)點作為莪術(shù)活性成分的關(guān)鍵作用靶點，共計17 個，在圖中為成分靶點集合內(nèi)圈。該17 個作用靶點分別與27 個藥物活性成分發(fā)生相互作用，如表2 所示。

2.3 藥物成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 Drug Bank、OMIM 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中以“Thrombosis”為關(guān)鍵詞搜索血栓相關(guān)疾病及靶點，獲得61 個疾病基因。將活性成分靶點-血栓靶點網(wǎng)絡(luò)文件導入Cytoscape 3.5.1，構(gòu)建莪術(shù)活性成分靶點-血栓靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2），提取靶點交集部分靶點共20個（表3），作為莪術(shù)活性成分抗血栓關(guān)鍵靶點，并制作蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖3）和活性成分-血栓靶點網(wǎng)絡(luò)（圖4），網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4 所示。

表1 莪術(shù)主要活性化學成分

圖1 莪術(shù)活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點的KEGG 分析和GO 分析 取上述關(guān)鍵靶點，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 分析。KEGG富集結(jié)果顯示，符合P＜0.05 的富集信號主要涉及凝血反應（Complement and coagulation cascades，Platelet activation）、神經(jīng)活性配體受體反應（Neuroactive ligand-receptor interaction）、腎素分泌（Renin secretion）、脂肪細胞脂肪分解（Regulation of lipolysis in adipocytes）等，見表5。

表2 關(guān)鍵靶點及對應的藥物成分

圖2 藥物活性成分靶點-血栓靶點網(wǎng)絡(luò)

表3 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點

利用Clue GO 插件，將莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點導入Cytoscape 3.5.1，篩選P≤0.05 的富集信號，獲取莪術(shù)抗血栓機制的生物學過程（Biological Process，BP）相關(guān)條目共計30 項，涉及cGMP 信號、凝血通路、蛋白激活通路、腺苷受體信號通路、血小板相關(guān)受體信號通路等，見圖5～6。

圖4 莪術(shù)活性成分-血栓靶點網(wǎng)絡(luò)

表4 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點拓撲參數(shù)

表5 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點KEGG 富集信號通路

圖5 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點的GO 富集分析結(jié)果

圖6 莪術(shù)抗血栓關(guān)鍵靶點的生物學功能注釋

3 討論

中藥由于成分多樣而出現(xiàn)“一藥多效”，近幾年來網(wǎng)絡(luò)藥理學的快速發(fā)展為其作用機制研究提供了新手段。它能夠?qū)⑺幬镒饔镁W(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)整合在一起，通過網(wǎng)絡(luò)特征分析快速高效地篩選中藥有效成分，分析成分之間可能的相互作用，并探討藥物成分的潛在作用靶點及發(fā)揮的生物學效應，簡化了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制的發(fā)現(xiàn)過程［7-8］。

課題組前期研究表明，莪術(shù)不同溶劑提取物具有抗血栓效果，然而具體作用機制不明。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預測，莪術(shù)中有29 種活性成分，莪術(shù)二酮、β-欖香烯、吉馬酮、姜黃酮等，可能通過作用于凝血通路（靶點為F2、F3、F9、F7、F10、FGA、PROC、PROS1、TFPI）、血小板聚集通路（靶點為FGA、PTGIR、PTGS1）干預凝血級聯(lián)反應和血小板激活聚集過程，從而發(fā)揮抗血栓作用。

F10（凝血因子X）和F2（凝血因子II）是外內(nèi)源性凝血反應的核心酶，介導凝血酶原的轉(zhuǎn)化和凝血酶的形成，聯(lián)合上游F3（凝血因子III）、F7（凝血因子VII）和F9（凝血因子IX）等內(nèi)外源性凝血關(guān)鍵因子，對最終的凝血過程和血栓形成具有決定性影響［9］。FGA 是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內(nèi)源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機體凝血過程［10］。蛋白C（PROC）和蛋白S（PROS1）是機體蛋白C 抗凝系統(tǒng)的重要組成部分，其中PROC 在血漿中為無活性的酶原形式，可被凝血酶活化為APC，PROS1 可協(xié)同APC 水解滅活部分活化的凝血因子（FVa、FVIIIa），減緩內(nèi)源性凝血速度［11］。

多項研究［5，12］表明，莪術(shù)可通過影響花生四烯酸代謝產(chǎn)物的生成，如6-keto-PGF1α（PGI2 代謝產(chǎn)物）和TXB2（TXA2 代謝產(chǎn)物），進而發(fā)揮抗血栓作用。本研究所預測的關(guān)鍵靶點和信號通路，血小板激活通路（platelet activation）及其關(guān)鍵靶點（FGA、PTGIR、PTGS1）與上述抗血栓機制關(guān)聯(lián)性較大，共有6 種化合物參與了該通路，且目前并未發(fā)現(xiàn)莪術(shù)相關(guān)物質(zhì)對這幾個相關(guān)靶點的研究報道。其中上述靶點分別編碼纖維蛋白原（Fg）、前列環(huán)素PGI2受體（IP）和環(huán)氧合酶1（COX1）3 種蛋白，IP 和COX1參與花生四烯酸代謝，影響花生四烯酸及代謝產(chǎn)物誘導的血小板聚集和血栓形成［13］。

此外，經(jīng)過活性篩選的莪術(shù)成分，共有5 種化合物可能與F2（凝血因子II）產(chǎn)生相互作用，鑒于F2 在凝血途徑中處于下游關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時也參與了血小板活化過程，F(xiàn)2 也是莪術(shù)多成分發(fā)揮抗血栓作用的關(guān)鍵靶點。

莪術(shù)二酮、β-欖香烯、吉馬酮等屬于莪術(shù)油活性成分，姜黃酮屬于姜黃素類成分，莪術(shù)油成分和姜黃素類成分的抗血栓作用在多項研究中也得到了證實，更佐證了該網(wǎng)絡(luò)藥理學預測方法的可行性［14-15］。