基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參麥注射液抗肺癌的扶正-祛邪機(jī)制

楊從影，易劍峰，包 梅，張秀美

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

參麥注射液源自明代秦景明《癥因脈治》 所載之參冬飲，由中藥紅參、麥冬提純精制而成［1］。古方以紅參為君，甘溫滋補(bǔ)、益氣生津；麥冬為臣，甘寒清熱、養(yǎng)陰止渴，一君一臣、一溫一寒相互配伍，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈的功效［2-3］，而參麥注射液不僅具有古方功效，更具有抗腫瘤、抗休克、提高免疫力、強(qiáng)心擴(kuò)管、抗心肌缺血、去除氧自由基等現(xiàn)代藥理作用［4］。研究［5-6］表明，紅參主要藥效成分為人參皂苷，有增強(qiáng)機(jī)體自身免疫、抗氧化和抗腫瘤效果；麥冬［7-8］有效成分主要為甾體皂苷和高異黃酮，有抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫力等藥理作用。早期研究［9］發(fā)現(xiàn)，參麥注射液主要有抗心衰、抗心律失常等治療心血管系統(tǒng)疾病的藥理作用；近年來(lái)不少學(xué)者［10-12］發(fā)現(xiàn)，它對(duì)體內(nèi)外Lewis 肺癌、肉瘤S180、肝癌H22 等實(shí)體瘤均有顯著的抗腫瘤作用；徐泳等［13］一項(xiàng)Meta 分析顯示，參麥注射液聯(lián)合含鉑一線化療藥物治療非小細(xì)胞肺癌，可增加抗腫瘤療效，提高患者生活質(zhì)量；朱亞蘭等［14］研究表明，參麥注射液輔助化療能提高肺癌等惡性腫瘤臨床療效。

盡管參麥注射液治療肺癌效果突出，但其具體的生物分子機(jī)制仍鮮有報(bào)道。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［15］概念的應(yīng)運(yùn)而生，生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、分子虛擬研究等手段的不斷進(jìn)步，可為研究中成藥多成分、多靶標(biāo)、多途徑的藥理機(jī)制提供了新的思路。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，運(yùn)用文獻(xiàn)檢索、分子在線模擬找靶、基因本體論分析、KEGG 通路富集分析等手段，對(duì)參麥注射液抗肺癌生物分子藥理機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，為明確其提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件 （1）ChemicalBook 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.chemicalbook.net）；（2）SIB 分子構(gòu)效相似性靶標(biāo)預(yù)測(cè)服務(wù)器（http：／／www.swissparam.org）；（3）Stitch 化學(xué)成分-基因相互作用預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／stitch.embl.com）；（4）GeneCards 基因數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET 疾病-基因關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)；（5）String 基因-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／stringdb.com）；（6）ClueGO 基因本體論富集分析插件；（7）DAVID v6.8 生物信息學(xué)分析平臺(tái)（https：／／DAVID.ncifcrf.gov／）；（8）Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)處理軟件；（9）R 語(yǔ)言繪圖工具。

1.2 參麥注射液成分的選擇 在CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“參麥”“參麥注射液”“成分”，將通過(guò)高效液相色譜及超高效、液質(zhì)聯(lián)用等檢測(cè)參麥注射液成分的文章納入，并從中挖掘主要藥效成分。利用Chemical Book 數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一核對(duì)名稱、CAS 號(hào)，創(chuàng)建mol2 格式文檔保存。

1.3 參麥注射液靶標(biāo)集合的構(gòu)建 （1）將參麥注射液有效成分mol 格式文檔導(dǎo)入SIB 分子構(gòu)效相似性靶標(biāo)預(yù)測(cè)服務(wù)器，預(yù)測(cè)其潛在靶標(biāo)；（2）利用Stitch 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘參麥注射液有效成分的潛在靶標(biāo)，參數(shù)設(shè)置為“l(fā)ow confidence 0.15；No more 20 interactors”。將2 種來(lái)源的靶標(biāo)建立交集，構(gòu)建參麥注射液靶標(biāo)集合。

1.4 肺癌相關(guān)靶點(diǎn)集合的構(gòu)建 本研究利用Gene Cards、Dis Ge NET 兩大基因-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找與肺癌密切相關(guān)靶點(diǎn)。以“Lung Neoplasms”為檢索詞，按照相關(guān)度分?jǐn)?shù)排序的方法，提取3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)與肺癌相關(guān)的前100 個(gè)靶點(diǎn)，建立交集，構(gòu)建肺癌靶點(diǎn)集合。

1.5 參麥注射液靶點(diǎn)-肺癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將參麥注射液靶基因與肺癌靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，背景設(shè)置為“Homo sapiens”構(gòu)建參麥靶點(diǎn)-肺癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)處理軟件，利用“NetworkAnalyzer”插件分析該網(wǎng)絡(luò)中心性靶標(biāo)參數(shù)?！岸戎担―egree）”“介數(shù)（Betweenness）”“最短距離（Closeness）”是分析網(wǎng)絡(luò)中心性的3 個(gè)最關(guān)鍵參數(shù)，度值、介數(shù)、最短路徑越大，節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)就越重要［16］。

本研究依據(jù)2 個(gè)原則選取參麥注射液抗肺癌靶點(diǎn)，（1）直接抗癌靶點(diǎn)，參麥注射液基因與肺癌基因共同的靶點(diǎn)，即參麥注射液靶點(diǎn)與肺癌靶點(diǎn)的交集；（2）間接抗癌靶點(diǎn)（網(wǎng)絡(luò)中心靶點(diǎn)），以度值、介數(shù)、最短路徑中心性的平均值為“臨界值”，取“參麥靶靶點(diǎn)-肺癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)”中“臨界值”以上的參麥注射液靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)起到了溝通參麥注射液和肺癌的樞紐作用，是參麥注射液調(diào)控肺癌的間接關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.6 GO 分析 GO 分析包括細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程3 個(gè)部分，其中生物過(guò)程最能體現(xiàn)靶基因的藥理特性，故本研究利用Clue GO 插件對(duì)參麥注射液抗肺癌靶基因進(jìn)行GO 生物過(guò)程富集分析，探究其潛在藥理作用。設(shè)置參數(shù)：定義來(lái)源為“Homo sapiens”，P≤0.05，Interval Min Level＝2，Max Level＝5。

1.7 KEGG 通路分析 將參麥注射液抗肺癌靶基因?qū)隓AVID v 6.8 服務(wù)器，對(duì)其進(jìn)行KEGG 通路富集分析，篩選出P＜0.05 的癌癥通路，并運(yùn)用R 語(yǔ)言繪圖分類，研究參麥注射液抗肺癌通路。

2 結(jié)果

2.1 參麥注射液主要活性成分 初檢得到有關(guān)文獻(xiàn)70 篇，其中符合“1.2”項(xiàng)下納入標(biāo)準(zhǔn)的有9 篇［7，17-24］，見(jiàn)表1。

通過(guò)檢索文獻(xiàn)，高效、超高效液相技術(shù)檢測(cè)到參麥注射液主要含有多種皂苷類藥效成分，其中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1，麥冬皂苷D，甲基麥冬二氫黃酮A、B 等9 種活性成分是其主要活性成分，能較好的代表參麥注射液進(jìn)行下一步研究。故將其統(tǒng)一保存為mol2 格式文件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。主要成分信息如表2 所示。

表2 參麥注射液主要活性成分

2.2 參麥注射液潛在靶標(biāo) 如表3～4 所示，利用SIB 服務(wù)器、STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)共發(fā)現(xiàn)參麥注射液9 種藥效成分對(duì)應(yīng)126 個(gè)潛在靶標(biāo)，其中人參皂苷類成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)數(shù)目多、藥理作用廣，可能是參麥注射液的主要藥效成分。

2.3 參麥注射液靶基因-肺癌基因網(wǎng)絡(luò) 如圖1 所示，在Gene Cards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)分別搜索相關(guān)分?jǐn)?shù)排序前100 的肺癌基因，建立交集后得到肺癌相關(guān)基因161 個(gè)。將“2.2”得到的126 個(gè)參麥注射液靶基因與161 個(gè)肺癌相關(guān)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建參麥注射液靶基因-肺癌基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。如圖2 所示，除去未發(fā)生相互作用的基因，共有260 個(gè)基因參與了關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，包含5 239 條相互作用連線。全網(wǎng)平均度值為30.46，平均介數(shù)為3.63×10-3，平均最短距離為4.64×10-1，其中包括16 個(gè)直接抗肺癌靶點(diǎn)（AKT1、CASP3、CHRNA3、CHRNA7、ESR1、KIT、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MET、MMP9、NFE2L2、RB1、STAT3、STK11、VEGFA）；有18 個(gè)靶點(diǎn)度值、介數(shù)、最短距離均超過(guò)了平均值，為網(wǎng)絡(luò)中心間接抗肺癌靶點(diǎn)（AKT1、VEGFA、MAPK3、STAT3、ESR1、SRC、CASP3、MAPK1、CREB1、MMP9、BDNF、MAPK14、STAT1、NOS3、FYN、ABCG2、F2、MAPT）。具體見(jiàn)表5。

表3 SIB 服務(wù)器靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果

表4 STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖1 肺癌相關(guān)基因韋恩圖

2.4 GO 分析 如圖3～4 所示，將25 個(gè)抗肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，共涉及52 個(gè)GO 生物過(guò)程條目，176 條相互作用關(guān)系。GO 生物過(guò)程條目可分為8 類，蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞核的正調(diào)節(jié)（45.16%）、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)（20.97%）、雌性性腺發(fā)育（14.52%）、紅細(xì)胞分化（6.45%）、卵泡分化（4.84%）、細(xì)胞對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）的反應(yīng)（3.23%），細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)（3.23%）、腎臟發(fā)育調(diào)控（19.1%）。其中，蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞核的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)均與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

2.5 KEGG 分析 如表6、圖5 所示，對(duì)25 個(gè)抗肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)參麥注射液能調(diào)控5 大類、22條與肺癌密切相關(guān)的通路，包括①腫瘤血管的形成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）等2 條信號(hào)通路；②腫瘤增殖相關(guān)的MAPK、PI3K／Akt、Ras、Rap1、ErbB、mTOR、ESR、FoxO 等8 條信號(hào)通路；③腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的黏著斑連接（Adherens junction）、縫隙連接（Gap junction）、黏著斑（Focal adhesion）等3條信號(hào)通路；④腫瘤免疫相關(guān)的腫瘤壞死因子、自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞受體、B 細(xì)胞受體等4 條信號(hào)通路；⑤其他與腫瘤代謝相關(guān)的腫瘤通路、非小細(xì)胞肺癌通路、腫瘤微小RNA 調(diào)控、腫瘤蛋白磷酸化、腫瘤碳代謝等5 條通路。

3 討論

圖2 參麥注射液靶基因-肺癌基因相互作用網(wǎng)絡(luò)

表5 主要抗癌靶點(diǎn)

肺癌在腫瘤相關(guān)死亡率中排名第一，具有較高的惡質(zhì)性和侵襲性［25］。中藥注射液能抑制肺癌發(fā)展，提高患者自身免疫，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性，在抗肺癌方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［26］，其中參麥注射液能緩解癌性疲勞，提高腫瘤緩解率，治療肺癌效果顯著［27］。本研究通過(guò)文獻(xiàn)檢索、分子相似性靶標(biāo)預(yù)測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘等方法，發(fā)現(xiàn)參麥注射液中主要含有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1以及麥冬皂苷D、甲基麥冬二氫黃酮A、B 等9 種成分，通過(guò)構(gòu)建靶基因-肺癌基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)它能直接、間接作用于MAPK1、CASP3、AKT1、MMP9、RB1、STAT1、VEGFA 等25 個(gè)核心靶標(biāo)，發(fā)揮抗肺癌作用。朱春燕［28］發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rd能通過(guò)下調(diào)MAPK 通路、激活caspase-3 通路，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖；劉彩宏等［29］實(shí)驗(yàn)表明，人參皂苷Rg1能抑制AKT 磷酸化，減緩細(xì)胞增殖與遷移；另有研究［30］證實(shí)，人參皂苷Rb1能濃度依賴性抑制MMP9 表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞侵襲能力下降；藺娜等［31］發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1有下調(diào)VEGF、MMP9 的作用；羅林明等［32］發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有多種抗腫瘤機(jī)制，能抑制RB 磷酸化、抑制MAPK、AKT、MMP9、STAT 等基因過(guò)表達(dá)，發(fā)揮多途徑抗腫瘤作用；此外，研究［33］表明麥冬皂苷、麥冬高異黃酮是麥冬的主要抗腫瘤成分，能通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移與發(fā)展；研究［34］發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷D 能抑制AKT 蛋白磷酸化，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲與遷移。以上報(bào)道與本研究結(jié)果基本吻合，證明參麥注射液抗腫瘤成分主要為人參皂苷、麥冬皂苷、麥冬高異黃酮，能通過(guò)多靶點(diǎn)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡、抑制肺癌的增殖與侵襲。

圖3 GO 功能注釋網(wǎng)絡(luò)

圖4 GO 功能注釋餅狀圖

本研究對(duì)參麥注射液25 個(gè)抗肺癌靶標(biāo)進(jìn)行GO 生物過(guò)程分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞核的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子、細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)等生物過(guò)程，以上生物過(guò)程與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究［35-36］表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，在肺癌新生血管生成、增殖擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用，而生長(zhǎng)因子調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移的主要途徑正是通過(guò)激活受體下游通路，激活定位與細(xì)胞核中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)腫瘤的增殖發(fā)展?；钚匝跏桥c細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要信號(hào)分子，能上調(diào)caspase 和BAX 表達(dá)、抑制BCL-2 表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡［37］。GO生物過(guò)程提示參麥注射液可能是通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)因子及其通路、活性氧途徑等分子機(jī)制，實(shí)現(xiàn)抗肺癌的藥理作用。

進(jìn)一步對(duì)參麥注射液25 個(gè)抗肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)參麥注射液能參與調(diào)控5 大類、22 條與肺癌密切相關(guān)的通路。（1）抑制腫瘤血管生成，傅華洲等［38］利用雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)證明參麥注射液總皂苷能抑制癌細(xì)胞VEFG 通路表達(dá)，具有抗腫瘤血管生成作用；顧蒞冰等［39］發(fā)現(xiàn)麥注射液能降低移植瘤LoVo 細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)，抑制HIF-1 介導(dǎo)的血管生成信號(hào)通路，降低腫瘤組織的微血管密度，與本研究富集的抗腫瘤血管生成VEFG 通路、HIF-1 通路相符；（2）抑制腫瘤增殖，已知MAPK、PI3K／Akt、Ras、ErbB、mTOR、FoxO 等信號(hào)通路均能促進(jìn)腫瘤的增殖分裂［40］，本研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液能調(diào)控以上信號(hào)通路抑制肺癌的增殖；王紅寧［41］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1、Re、Rg1 能影響MAPK 細(xì)胞信號(hào)，抑制白血病細(xì)胞的體外增殖；陳美娟等［42］發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷D 等成分能下調(diào)PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路，對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H157 體外抑制作用明顯；均說(shuō)明參麥注射液有效成分能通過(guò)抑制多種促腫瘤增殖信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗肺癌的藥理作用；（3）抗腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液能調(diào)控縫隙連接、黏著斑連接相關(guān)通路抗肺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。王蘇萍等［43］發(fā)現(xiàn)人參總皂苷能影響黑色素瘤B16 細(xì)胞縫隙連接功能，促進(jìn)Cx2 等蛋白表達(dá)，抑制腫瘤的增殖；提示參麥注射液具有抗肺癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用；（4）調(diào)節(jié)腫瘤免疫功能，本研究富集結(jié)果表明，參麥注射液有調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）及自然殺傷細(xì)胞（NK）、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫功能的作用；賈珍等［44］臨床研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液能調(diào)控T 細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+）及NK細(xì)胞，改善腫瘤患者免疫功能和生存質(zhì)量；（5）其他與腫瘤代謝相關(guān)的腫瘤通路，該部分通路在以上4 類信號(hào)通路中均有體現(xiàn)，比如腫瘤通路、非小細(xì)胞肺癌通路正是由MAPK、VEGF、HIF-1 等信號(hào)通路交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而成。

表6 KEGG 通路

圖5 KEGG 信號(hào)通路富集

總之，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)參麥注射液主要成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)它能通過(guò)“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”抑制肺癌的增殖發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成，實(shí)現(xiàn)祛邪作用；通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體腫瘤免疫、腫瘤代謝，達(dá)到扶正效果。